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1、第8章 新品种培育,体外单倍体诱导通常是指利用离体培养花药或小孢子的方法，诱导形成单倍体植株。花粉植株的形态发生方式有三种：愈伤组织型；类胚体型；混合型 单倍体育种是指将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯和二倍体，从中筛选出优良个体，直接繁育成新品种；或选出具有单一优良形状的个体，作为杂交育种的原始材料。,一、 植物小孢子发育过程,首先，初生造孢细胞经过多次分裂产生小孢子母细胞。 小孢子母细胞发育到成熟的花粉粒的过程可分为三个时期： 第一期，小孢子母细胞通过减数分裂形成四分体; 第二期，四分体分离开后，单个小孢子继续发育; 第三期，小孢子发育成成熟的花粉粒。,二、花药和花
2、粉培养,1、花药培养（anther culture） 花药培养比花粉培养快捷，是单倍体培养的主要手段。 花药再生植株的产生有两种方式，器官再生和胚状体再生。 胚状体再生有两个特点 两极性 与外植体的维管束无直接联系,2、 花粉培养（pollen culture） 花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。 （1） 裸子植物的花粉培养 研究相对较少，典型的树种有麻黄、银杏、紫杉、榧等。 （2）被子植物的花粉培养,被子植物成熟花粉不容易进行离体培养，通常采用特殊方法，如悬滴培养（Kameya等 ，1970）或看护培养（sharp等， 1972）。 水稻和烟草花粉
3、可采用直板培养法进行培养。,3、小孢子母细胞培养 小孢子母细胞培养主要用于研究减数分裂和花粉发育。 1967 年Ito和Stern培养无瓣 延龄草和麝香百合的小孢子母细胞获得成功，得到了四分体小孢子。 Nitcsh等采用变温处理的方法改变小孢子母细胞的发育途径，并诱导出胚状体。 对大多数植物来说，小孢子分离系统还没有建立起来，目前一种有效的小孢子分离系统已经应用于油菜小孢子培养。,三、花药与花粉培养方法,1、材料的选择 （1） 材料的遗传变异 首先，不同物种之间花药培养的反应存在跟大差异；此外，同一属内不同种或品种之间也存在诱导性的差异。 母本材料的基因型是影响花药培养的关键因素，不同基因型植
4、株的花药对培养的反应不同。花药培养的诱导率也与杂种优势有关，一般情况下杂种比纯种容易诱导。,（2） 母本生理状态的影响 母本生理状态直接影响花药培养力 母本的氮素营养水平是另一个重要的影响因素 （3） 花粉发育时期 被子植物的花粉发育过程经历三个阶段，即第一期四分体时期、第二期单核期（小孢子阶段）、第三期双核期和三核期（雄配子体阶段）。单核期又分为单核早期、但和中期、单核晚期。,对大多数植物来说，单核中期和晚期是诱导花粉胚或花粉愈伤组织的最佳时期，尤其单核靠边期是花粉诱导的关键时期。 不同植物的花粉对离体培养有其特定的、最敏感的发育时期，然而，对大多数植物，单核期的花粉比较容易培养。 具有无限
5、数目花药的植物，取材比较方便，具有有限数目花药的植物，按顺序找出小孢子发育时期不同的花药。 将镜检结果与花蕾发育状态进行对比，发现花蕾状态与花粉发育时期的对应关系，为进一步取样培养奠定基础。 供体植物的遗传背景对单倍体的诱导影响甚大。,2、材料的预处理 （1）低温处理 研究表明，低温预处理能明显提高花粉胚的诱导率。 不同材料采用的低温处理温度和时间有一定差异。 低温处理提高花粉诱导率的作用机制存在两种观点：Nitsch(1973)和 Sunderland(1978)分别提出 （2）高温处理 （3）离心处理 离心对二核期花粉无效 （4）激光照射 （5）乙烯利处理 （6）甘露醇处理 卫志明等（19
6、93）首先提出，甘露醇预培养对小麦游离小孢子培养有促进作用。,3、培养基 A、基本培养基 常用的花粉培养基本培养基有MS、Nitsch、B5、BN、BH、MB、N6、H、Miller等多种 （1）碳源：蔗糖是常用的碳源，蔗糖不仅作为碳源，同时也可调节渗透压剂。 （2）激素：在脱分化培养基中细胞分裂素和生长素共同作用是十分重要的；在分化培养基中，细胞分裂素是主要的诱导激素，一般也配合使用生长素；通常采用生长素单独或配合使用诱导生根，适用浓度0.0253.0mg/L不等。,（3）附加成分 B、条件培养基 利用组织培养物产生分泌物进入培养基，使得培养基条件化，成为条件培养基。经过条件化的培养基可以促
7、使培养细胞的分裂和分化。 异种花药、子房组织也可使培养基条件化，这揭示了植物组织在培养过程中分泌的某些物质对细胞分裂和生长普遍起作用。,4 接种与再生植株的培育 A、材料的灭菌处理 （1）5%10%漂白粉水溶液的上清液浸泡1015分钟； （2）8%10%安替福民浸泡510分钟； （3）0.1%升汞浸泡10分钟。 B、培养条件 一般温度控制在2830 比较适宜 不同植物对光照的反应不一,C、花粉植株（pollen plant）的培育 花粉植株可以通过花粉胚或花粉愈伤组织诱导产生。 在产生花粉胚的情况下，小植株直接从花药囊中长出来。 花粉愈伤组织需要在分化培养基和生根培养基上培养，诱导产生芽和不定
8、根。 移栽后花粉能否成活取决于管理措施。 离体花粉培养条件包括温度和光照。离体培养的花粉对温度比较敏感。,D、花粉植株的鉴定 花粉植株的鉴定方法有： 形态鉴定； 细胞学鉴定； 杂交鉴定法； 分子标记鉴定。 E、单倍体植物的染色体加倍 对单倍体的染色体加倍，使之成为可育的二倍体，是育种过程中很重要的一个环节。 (1)小苗浸泡法 (2)生长锥处理法 (3)培养基加倍法,四、 单倍体育种在生产实践中的应用,单倍体植物由于其独特的性质，在育种和研究中具有广泛的用途。,五、马铃薯单倍体育种 马铃薯普通栽培种为同源四倍体, 遗传分离复杂, 出现理想组合的几率小, 育种效率较低。通过单倍体培养使其倍性降低,
9、 再人工加倍有望得到相对稳定的纯系, 这样可省去多代自交, 短期内获得纯合四倍体, 大大提高育种效率。 四倍体马铃薯由于显性基因存在, 所需的隐性基因不能表达。利用单倍体可使隐性基因得以表达, 提高选择效率。,马铃薯单倍体培养的方法 1. 孤雌生殖 2. 小孢子的培养( 花粉培养) 3. 花药培养,1. 孤雌生殖 人工诱导孤雌生殖的方法有活体诱导和离体诱导两种。 活体诱导是利用在二倍体中发现的能产生2n配子花粉的诱导者, 通过种间杂交, 诱导四倍体普通栽培种孤雌生殖产生双单倍体。 离体诱导孤雌生殖主要是未受精子房培养, 这对于阐明果实的形态发生、生理生化等过程提供了一个很好的实验系统。,2.
10、小孢子的培养( 花粉培养) 该项技术由Nitsch 和Noreel 创建, 。由于操作难度大, 70 年代这项技术仅在曼陀罗、矮牵牛和烟草等3 种茄科模式植物上取得成功。 高秀云对马铃薯小孢子的培养发现, 马铃薯小孢子经均等分裂形成愈伤组织或胚状体, 分别用MS + KT 1 mgL- 1 + 2, 4- D 0.25 mgL- 1 + 蔗糖3%和MS + KT 0.2 mgL- 1 + NAA 0.2 mgL- 1 + 蔗糖3%诱导愈伤和胚状体效果好, 发生频率分别为3.98%和0.8%。含有活性炭的培养基, 几乎都能诱导产生胚状体。初步认为低浓度的激素和生长素有利于马铃薯胚状体的诱导。 左
11、秋仙等16采用液体浅层培养法培养四倍体栽培种花粉仅得到愈伤组织, 未获得再生植株。,3. 花药培养 我国学者在马铃薯花药培养方面进行了广泛的研究, 取得了一些重要的理论与实践成果。 方法是诱导和培养外植体花药经由胚状体途径,培育出再生幼苗。一般选取单核中期到单核后期发育阶段的花药, 经过预处理和材料灭菌, 接种到适宜的培养基上进行诱导, 34 周后就可以由裂开的花药长出愈伤组织,再转移到分化培养基上分化出有正常根茎叶的再生植株，移栽于灭菌的土壤中。,戴朝曦等以四倍体普通栽培种为材料, MS附加NAA 2 mgL-1、2, 4- D 1 mgL-1、KT 0.5mgL-1、活性炭0.3%和马铃薯
12、块茎提取液5%的培养基培养单核期的花药, 在接种的20720 枚花药中诱导出愈伤组织204 块, 胚状体24 个和胚性细胞团3 块,总诱导频率达1.11%, 共分化出61 株绿色小植株,小植株的诱导率为1.35%。实验中观察到加入活性炭0.3%和马铃薯块茎提取液5%可明显提高诱导效果。,六、植物染色体工程,（一）概念 植物染色体工程技术包括植物染色体倍性改造和非整倍体改造。 染色体倍性改造工程是指有目的、有计划的增加或减少一组或几组同源或异源染色体，以创造我们所需的动植物新品种的一项染色体工程技术。 植物染色体的非整倍体改造是按照人们预定的目标,通过有计划的削减、添加和代换同种或异种的一个或若
13、干条染色体或其一部分，可以在一定程度上达到定向改变植物的遗传性、选育新品种的目的。,（二）染色体加倍技术 可分为自然加倍和人工诱导加倍两种。 效率较低 包括化学方法和生物学方法,化学诱导方法（最常用） 药剂：秋水仙素(colchicine) 、细胞松弛素 B(cytochalasinB,CB）、富民农等。 实验表明：一般以0.2%-0.5%的水溶液浓度效果较好。 处理温度的高低对诱导加倍的成功率有直接关系。 通常，温度低时，则浓度要大，时间要长；反之 浓度低，时间要短。处理的部位应是植物细胞分 裂旺盛的部位（如茎尖和芽的分生组织）。,生物学方法 生物学方法主要是通过杂交方法，尤其是种间或不同属
14、、科间的远缘杂交，也成为染色体组的合并技术（chromosome set fusion）。 远缘杂交技术 两大困难： 由于生殖隔离造成交配困难； 即使交配成功，但因染色体组受平衡作用而难以通过减数分裂使合并的异源染色体组在后代固定下来。,生殖隔离表现： 花期不遇 花芽发育的生态条件不同 生殖生理反应的差异,克服方法： 多倍体法 选择适当的亲本及正反杂交法 混合花粉授粉法 重复授粉法 预先无性近和随后相互异花授粉法 利用其他技术（eg:生长激素以及蔗糖液处理柱头或花粉）,体细胞杂交技术（somatic hybridization） 可以实现超远缘种间、属间甚至科、目间染色体的合并。 Eg: 粉蓝
15、烟草（2n=24) 和 郎氏烟草（2n=18)杂交获得成功 培养成杂种植株具有双亲的染色体组（24+18=42） 因此，体细胞杂交是实现异源染色体合并的一个最有效的 途径，完全克服了远缘物种间杂交的生殖隔阂的障碍。,（三）植物的多倍体育种,同源多倍体：如果加倍的染色体组来自同一物种或在原有染 色体组的基础上加倍而成这样的个体称为同源 多倍体。 与二倍体的比较：形态的巨大性，叶片、花朵、果实、植株 都明显增大；生理上表现为代谢活动增 强，糖类蛋白质及其他产物含量提高。,桔梗,下页,异源多倍体：指加倍的染色体组来源于不同的物种。 Eg:八倍体小黑麦。 同源&异源多倍体的区别： 异源多倍体的诱发材料
16、是远缘杂种，在诱发前需进行不同植物的远缘杂交，才能获得诱发材料。 异源多倍体的产生实际上包含着两个不可分割的步骤：远缘杂交&杂种的染色体加倍。,（四）植物的单倍体育种,现在普遍认为，不论细胞本身含有几个染色体组，只要细 胞中含有正常体细胞的一半染色体数即具有配子染色体数的 个体叫做单倍体。 由于单倍体上的每个基因都能显示相应的性状，所以极易 发现所产生的突变（尤其隐性），在表型上可以直接表现 出来。,方法： 诱发孤雌生殖 孤雌生殖是指雌雄配子未经融合，而由雌配子单性发育成种子的一种无融合生殖。 花药和花粉培养（最行之有效！）,（五）植物染色体非整倍体改造,染色体的削减 单体植物（monosomics）:从细胞中去掉一条染色体，则 染色体数成为2n-1，这样的植 物叫做单体植物。 这一技术称为染色体
