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1、第五章 代谢物酶法分析技术,全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版）,2,代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。,酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。,代谢物酶法分析技术的概念,3,4,平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（1%5%）时，指示反应信号逐渐达到平衡，即通常所说的终点，所以又称为终点法(end-point method)。,平衡法的特点是测定底物的总变化量， 即测定的是“浓度”
2、。,5,速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法，测定的是速率（通常指的是初速度），依据是当底物的消耗量较小时(5%)，酶促反应呈一级反应，此时的反应速度（v）与代测物的浓度成正比例。,速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。,6,在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 5%，只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固定时间法(fixed assay)。,7,平衡法的开始一段时间都有可能遵循一级反应规律。相反，速率法只要时间足够长，也会达到平衡。对于平衡法来说关键是确定达到平衡所需的时间。对于速率法来说关键是如何使酶促反应成一级反应。,
3、返回章目录,8,酶作用的特异性高，血清等体液样品不需预处理就能测定，简化了实验程序； 试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品对环境的污染； 酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析。,代谢物酶法分析主要优点,代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性测定范围等方面都优于传统的化学法,9,待测物与产物在理化性质上有便于检测的信号，如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析的方法称为直接法。,10,单底物反应直接测定法,尿酸 + O2 + H2O,尿囊素 + CO2 + H2O2,胆绿素+ H2O,胆红素 + O2,尿酸在293 nm 处有吸收，而尿囊素没有吸收，在2
4、93 nm 处测定吸光度下降,胆红素在450nm处有吸收，而胆绿素没有吸收，在450nm处测定吸光度下降,尿酸紫外法测定,胆红素测定,11,双底物反应直接测定法,对于双底物反应，为了便于实验分析，在实验设计时一般将所加的另一种底物浓度设计得相当大，即S2 Km2，这时的酶促反应动力学可按单底物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应动力学。,但在以NADH 或NADPH 为底物的终点法测定中，因340 nm 吸光度的限制，辅酶的用量不可能过高。,12,在340 nm 处测定吸光度的增加来进行定量的方法,乳酸测定,双底物反应直接测定法,乳酸 + NAD+,丙酮酸 + NADH + H+,丙酮酸
5、测定,在340 nm 处测定吸光度的下降来进行定量的方法,乳酸 + NAD+,丙酮酸 + NADH + H+,13,酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的的方法称酶促偶联法。,最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。,14,脱氢酶指示系统,氧化型辅酶NAD(P)+ 在340 nm 处没有吸 收峰, 还原型辅酶 NAD(P)H在340 nm 处有吸收峰.,15,脱氢酶指示系统,以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶(NAD+) 或氧化型辅酶(NADP+)变为还原型NAD(P)H后在340 nm
6、处的吸光度增高来计算出被测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型NAD(P)H 变为氧化型NAD(P)+，测定340 nm 处吸光度的下降来计算被测物的浓度。,16,脱氢酶指示系统,血清葡萄糖己糖激酶法测定,Glu + ATP,G-6-P+ADP,G-6-P + NADP+,P-6-GA + NADPH + H+,指示酶反应将NADP+转化为NADPH + H+，测定340 nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比,17,脱氢酶指示系统,血清尿素测定,尿素 + H2O,2NH3 + CO2,NH3 + -酮戊二酸 + NADH + H+,谷氨酸 + H2O + NAD+,测定340nm吸光
7、度下降的速度与尿素的含量成正比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定,18,常用的试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。,体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁 酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及 氨、钾、镁等离子的酶法测定大多使用该指示 系统。,脱氢酶指示系统,19,过氧化物酶指示系统,共用的指示反应最早由Trinder氏等人提出，被称为Trinder反应,最大吸收峰为500nm，在可见光范围内比色。已广泛用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三酯等项目的测定,20,过氧化物酶指示系统,血清总胆固醇氧化酶测定法,胆固醇酯 + H2O,胆固醇 + O2,胆
8、固醇 + 脂肪酸,4-胆甾烯酮 + H2O2,红色醌类化合物,H2O2 + 4-AAP + 酚,指示酶反应生成的红色醌类化合物可在500 nm 处比色测定,21,过氧化物酶指示系统,常用的Trinder反应生色基团,表内这些酚类衍生物，有的是提高生色基团的稳定性和溶解度、产物的灵敏度和稳定性；有些生色基团的产物是兰色醌类，能避免溶血等色素干扰。,22,利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。,酶循环法(enzymatic cycling assay)的灵敏度决定于循环反应速
9、度和时间，循环反应速度又取决于两种试剂酶( Ea 和Eb) 的量。该法测定中所选择酶的Km 值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。,23,使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质(或其衍生物)或靶物质的氧化产物作为底物循环。,检测指示系统： 循环前、后用速率法测定NADH(340 nm) 的变化。检测产物H2O2可通过Trinder 反应比色测定。,产物循环氧化酶脱氢酶系统,24,产物循环氧化酶脱氢酶系统,甘油浓度测定,通过GPO和G-3PDH使G-3P 与DHAP之间循环，在反复循环中G-3P 和DHAP 的量不变，而产物H2O2 随每次循环不断递
10、增，同时NADH 递减。在规定时间t 内，H2O2 累计的量决定于t 和每min循环次数。,25,底物循环脱氢酶辅酶系统,用一种脱氢酶和两种辅酶( thio-NAD+ 和NADH)。用395 nm 415 nm 波长测定反应中氧化型thio-NAD+ 转为还原型thio-NADH的增加速度。,循环反应条件： 酶对thio-NAD+ 和NADH应有高度亲和力。 溶液pH 和缓冲体系同时有利于双向反应。 thio-NAD+ 和NADH 二者的浓度和配比达最适条件。,26,底物循环脱氢酶辅酶系统,血淸胆汁酸测定,胆汁酸与3-酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代还原型辅酶（黄色），控制好条件，反应速度与
11、代测物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。,27,氨循环合成酶脱氢酶系统,NH4+在NAD合成酶和Mg2+存在下催化脱氨-NAD转化为NAD+，经脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和NH4+同时生成NADH，生成的NH4+进入循环再次生成NADH，在340nm测定。,28,酶循环法具有的特点,灵敏度随反应时间的延长而提高 灵敏度随酶在扩增反应中的用量而提高 利用酶对底物的特异性,使测定系统简化 利用四唑盐类的显色反应可实现比色测定,29,酶活性恢复法,很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才发挥其催化活性。脱去酶中关键的无机离子、微量元素或辅酶之后，酶即失去了其催化活性，无活性的酶与标本混合，标
12、本中的无机离子、微量元素或辅酶使该酶重新复活，复活的比例可以反映这些无机离子、微量元素或辅酶的含量。,30,异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子,酶活性恢复法,异柠檬酸+ NADP+,-酮成二酸 + CO2 + NADPH+H+,用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA) 抑制钙离子，标本中Mg2+通过恢复ICD 活性，催化异柠檬酸脱氢的正向反应，使NADP+还原，与镁标准一起在340nm测定吸光度的増加。,31,酶活性恢复法应用举例,丙酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾离子 -半乳糖苷酶法测定钠离子 淀粉酶法测定氯离子 超氧化物歧化酶法测定铜离子 碳酸酐酶或碱性磷酸酶法测定锌离子等,32,激活和抑
13、制法,有机磷是乙酰胆碱酯酶的抑制剂，用标准乙酰胆碱酯酶与标本在37水浴10min，测定剩余的乙酰胆碱酯酶的活性，被抑制的乙酰胆碱酯酶的活性可以计算出标本中有机磷的含量。,有机磷的酶法测定,根据酶有否激活剂和抑制剂存在时酶促反应动力学发生改变来测定激活剂和抑制剂的含量。,另有抑制ALP法测定茶碱、激活HK法测定镁离子等。,返回章目录,33,试剂酶质量,试剂酶概念,试剂酶特征,试剂酶纯度,酶法设计要求,酶法设计共性要求,平衡法设计的要求,速率法设计的要求,试剂酶来源,34,试剂酶是指作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性的一类酶。它是酶试剂的核心，它的质量是酶试剂质量的决定性因素。,试剂酶的概念,3
14、5,主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。基因重组酶蛋白也有应用，活力高，杂酶含量少且价格低廉。,不同来源的同一种试剂酶有不同的理化特征。必须掌握专一性和分子量、等电点、Km、最适pH，最适温度等，并熟悉辅助因子、激活剂和抑制剂对酶活性的影响。,试剂酶的来源和理化特征,36,不同的酶试剂系统对试剂酶的纯度有不同的要求。以NAD(P)H为指示反应中，要求试剂酶有较高的纯度。而在Trinder反应中要求相对低一些。,纯度主要指标 酶的比活性，酶的比活性越高，酶的纯度越高。杂酶含量，容易引起副反应的一些酶含量按 “允许限度”的要求（见表5-2）。,试剂酶的纯度要求,37,表5-2常用试剂酶的理化特
15、征及质量要求,38,39,40,所用试剂酶的特异性： 怎样消除干扰因素： 试剂中的附加剂： 如何提高灵敏度：用PMS或黄递酶，将NADH上的氢交给四氮唑盐，在可见光监测； 用酶循环法； 测定荧光法。,酶法设计的共性要求,41,酶的用量要足够大，能使反应1 min3 min 达到平衡，以保证较快完成测定。 反应要朝正反应方向进行，如果反应的平衡常数太低，可用增加底物浓度、偶联反应移去生成物、改变反应pH 等方法,并设标准管一起到达平衡以后测定。 Km 在保证测定线性的前提下要尽量小。,平衡法设计的要求,42,所用酶的 Km 应足够大，以保证测定线性和较长的反应动态期。Km 太小，可加入竞争性抑制剂加大 Km。 酶用量要合适，用少了可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。一般认为酶用量比平衡法小。 速率法酶促反应受很多因素影响，只有很好控制反应速度（v）才与代测物的浓度成正比例。,速率法设计的要求,43,另外，平衡法的试剂酶活性下降对测定影响远没有速率法明显，仅使达到平衡所需时间延长，检测范围变窄。但对速率法是致命的，可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。由于以上种种原因，代谢物酶法分析大多选择平衡法。,返回章目录,
