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1、大肠杆菌耐喹诺酮类机制分子生物学基础的初步研究,深圳南山人民医院传染科（518052） 邓启文,1,引言,随着氟喹诺酮类药物在临床的广泛应用，其耐药菌株日益增多。氟喹诺酮类的作用的靶位是细菌的DNA回旋酶。为了了解大肠杆菌对其耐药的分子生物学机制，我们对6株耐药菌1株敏感菌和1株标准株（ATCC25922）的gyrA基因的N末端编码区进行了PCR-SSCP及序列测定分析以检测gyrA基因突变。,2,材料和方法（1）,菌株的收集 4株大肠杆菌耐药菌株及1株敏感株来自我院院感科及检验科，其中3株来自尿液标本2株粪便培养标本。均经过常规生化及血清学鉴定。大肠杆菌标准株ATCC-25922购自中国药品
2、生物制品检定所。,3,材料和方法（2）,药敏试验 诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星药敏纸片购自浙江省军区后勤部卫生防疫检验所。药敏试验采用Kirby-Bauer法，结果按NCCLS1993年版标准制定。,4,材料和方法（3）,主要试剂 扩增DNAgyrA两条外引物为：5-GAGGAA GAGCTGAAGAGCT CCT-3及5CCGGTAC GGTACGGTACGGTAAGCTTCTTCAA-3分别位于gyrA4061位碱基及686707位碱基，两条内引物为5-TCCGTCGCCTACTTT ACGCC-3及5-TCGGCGAAATCGACCG TC-3分别位于gyrA133-152位碱基及420
3、-439位碱基。,5,材料和方法（3）续,上述引物委托上海生物细胞研究所DNA合成部合成。合成仪为Beckman Oli- go1000型。dNTP、Tag酶、Wizard聚合酶链反应产物纯化试剂盒购自北京华美公司。DNA测序试剂盒为Perkin-Elmer之末端标记试剂盒。胰化蛋白胨酵母浸膏、NaCl、琼脂糖、甲醇、甲醛、乙酸、重铬酸钾、硝酸银、酚、氯仿等为国内分析纯试验。,6,材料和方法（4）,PCR扩增gyrA 按参考文献（1）方法。1ml过夜培养大肠杆菌10000g，5min收集沉淀，加入200ulTE缓冲液（PH8.0）混悬，加入溶菌酶37温浴。10%SDS 3730min，蛋白酶K
4、56水浴1h后，用等量酚，氯仿抽提后作模版DNA。,7,材料和方法（4）续,第一次PCR反应体积50ul，含10PCR缓冲液5ul，MgCl22ul，dNTP2.5ul，Tag酶2u，模版2ul，外引物各50pmol（2ul），第二次PCR50ul反应体积中含第一次PCR产物1ul、内引物各2ul，余同第一次PCR反应体积。PCR条件：94预变性5分钟；941分钟，561分钟，7245秒，共35个循环。反应结束后72延伸10分钟。PCR仪为美国Perkin-Elmer公司的PE480热循环仪。,8,材料和方法（5）,GyrAPCR产物的单链构象多态性（SSCP）分析： 取第二次PCR产物5ul
5、，94%去离子甲酰胺和溴酚蓝各5ul混匀后置85水浴变性5分钟，然后迅速放入0冰水中使DNA处于单链状态。,9,材料和方法（5）续,配制5%聚丙烯酰胺凝胶（内含5%甘油），取1.5ul变性混合物上样。0.5TBE为电泳缓冲液，15电泳。取出凝胶后在无离子水中浸泡30分钟后：50%甲醇，12%乙酸10分钟；10%甲醇，5%乙酸10分钟；3.4mmol/L重铬酸钾；3.2mmol/L硝酸5分钟；1.2 mmol/LAgNO320分钟，0.28 mmol/L碳酸钠，0.5ml/L甲醛5分钟后终止反应。观察结果。,10,材料和方法（6）,PCR产物测序 利用WizardPCR产物纯化试剂盒，按产品说明
6、纯化gyrA产物，纯化产物后以外引物为引物，用末端标记测序试剂盒在自动测序仪上进行测序。,11,结果 （1）GyrAPCR扩增结果,Gyr第一次PCR扩增产物为668 Vpb片段；第二次为307 bp片段（图1）,12,13,结果（2）GyrA PCR-SSCP结果（图2）,标准株及临床分离敏感株gyrA PCR-SSCP结果两条DNA单链处于同一位置。4株耐药菌株其结果与临床敏感株及标准株DNA单链结果不同，说明有碱基变异存在。,14,15,结果（3）DNA测序结果及推定氨基酸序列 （1）,A株在gyrA基因碱基序列的第259位有GA突变，致Asp-87Asn。第267位有TC突变，为无意突
7、变。B株在247，259，300，332，552位分别有CT，GA，TC，TC，CA突变，其中247位致Ser-83Leu，259位致Asp-87Asn，552位致His-184Asn（图3）其余为无意突变。,16,图5,17,18,讨论（1）,DNA回旋酶（DNA gyrase）是细菌特有的一种拓扑异构酶，它能够利用ATP水解的能量将共价闭合环状DNA转变为负超螺旋DNA，对DNA的复制、转录、重组和修复过程有着重要作用（3）。该酶由A、B两个亚单位组成。A亚单位参与酶反应中DNA链的断裂和重接，B亚单位参与酶反应中能量的转换和ATP的水解。,19,讨论（1）续,喹诺酮类药物作用的靶位是细菌
8、的DNA回旋酶，阻止DNA的超螺旋型转化产生杀菌作用。 DNA回旋酶A单位（gyrA）发生点突变是造成细菌产生耐药性的主要原因（4）。国外研究以发现gyrA基因突变位点集中发生在N末端核苷酸序列为199-318的区间内，即所谓氟喹喏酮类药物耐药决定区。,20,本研究根据gyrA基因已知序列（6），针对氟喹喏酮类药物耐药决定区区域设计了两对引物，经PCR反应后，扩增出307bp片段，与预期结果相符。自1989年Orita等（2）首次报道单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）分析技术以来，SSCP技术已成为基因突变的快速筛选和检测
9、的重要手段。,讨论（2）,21,讨论（2）续,其原理是序列不同的单链DNA，形成不同的构象，在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁徙率不同形成不同的条带。本研究表明大肠杆菌标准株和敏感株gyrA基因电泳后在同一位置，碱基未发生变化。而4株耐药菌株其DNA单链与标准株及临床敏感株迁移率不同，可以推论4株耐药菌株其gyrA基因发生了突变。,22,讨论（3）,通过DNA序列测定分析发现a株、b株、d株同时存在Asp-87Asn，、b株、d株同时存在Ser-83Leu，b株还有His-184Asn突变，其余突变为无意义突变，突变的碱基以CT为主。Ser-83Leu及Asp-87Asn突变位于氟喹酮类药物耐药决定
10、区，与文献（4，5）报道相同。,23,讨论（3）续,本研究发现的gyrA基因氨基酸184位点CA碱基突变致组氨酸突变为无冬酰氨尚未见文献报道，因此我们认为我院分离的大肠杆菌对氟喹酮类药物产生耐药性与gyrA基因的点突变有关。,24,讨论（3）续,e株虽然存在碱基突变并未导致氨基酸的变异为无意突变。其耐药可能与细菌膜对药物通透性下降或主动流出系统有关。,25,参考文献（1）,1金冬雁，黎孟枫，译。分子克隆实验指南。第二版，北京：科学技术出版社。1992.49-55. 2Orita M, Suzuki Y, Sekiya T, et al. Rapid and sensitive detectio
11、n of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction. Genomics. 1989,5.74. 3Reece RJ, Maxwell A. DNA gyrase structure and function critical Reviews in Biochemistry and Molecular biology. 1991.26:335.,26,参考文献（2）,4Lewin CS. Allwn RA, Amges SGB. Potential mechanisms of resista
12、nce to the modern fluorinated 4-quinolones. J Med Microbiol. 1990,31:153-161. 5Yoshida H, Boyaki M, Nakamura M, et al. Quinolone resistance determining region in the DNA gyrase A gene of Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother 1990,34: 1271-1272. 6.S.L.Swanberg, J C.Wang. Cloning and sequencing of the Escherichia coli.gyrase A gene Coding for the A Subunit of DNA gyrase. J Mol Biol. 1987,197:729-736.,27,谢 谢 大 家 ！,Thank you！,28,图3,29,
