2010本科生第7讲课件

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1、发酵培养-四,第七讲 工业发酵染菌的防治 1、染菌对发酵的影响 2、污染杂菌的途径和染菌的判断 3、污染杂菌的原因分析 4、发酵染菌的预防 5、发酵染菌后的措施,1、染菌对发酵的影响 染菌：感染了对正常发酵有影响的其他腐败微生物或噬 菌体。 几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂菌的污染。染菌 的结果，轻者影响产量或产品质量，重者可能导致倒 罐，甚至停产。,1.1染菌的危害： 1.1.1 分解产物 青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌（细短产气杆菌）都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。 1.1.2 导

2、致发酵过程异常 菌体生长速度缓慢、菌体代谢异常或过早老化、pH发生异常变化、发酵过程中泡沫异常增多，发酵液颜色异常变化、代谢产物含量下跌、发酵液黏度异常增加。,1.1.3 影响产物的提取、产品质量 对过滤的影响： 发酵液的粘度加大，菌体大多自溶 由于发酵不彻底，基质的残留浓度加度。造成的后果： 过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡 大幅度降低过滤收率。,对提取的影响 有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开 离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量。,对产品质量的影响 对内在质量的影响

3、：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。对产品的纯度有较大影响。 对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。,1.1.4 染菌对三废处理的影响 使过滤后的废菌体无法利用。 BOD含量增高，增加三废治理费用和时间.,1.2不同染菌时间对发酵的影响,发酵前期染菌：杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成 发酵中期染菌：严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成 发酵后期染菌：如杂菌量不大，可继续发酵。如污染严重，可采取措施提前放罐,1.3 不同染菌途径对发酵的影响,种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性。 空气带菌：空气带菌也使发酵染

4、菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐。 培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性。 设备渗漏：发酵环境与外界连通，这种途径造成染菌的危害性更大。,2、污染杂菌的途径和染菌的判断,2.1染菌的途径 杂菌侵入的途径在工业上不外乎原料，菌种，空气，设备四个方面。 原料方面、种子方面、无菌空气、设备方面,从三方面进行： 2.2.1 无菌试验 2.2.2 显微镜检查 2.2.3 生理生化指标的变化,2.2染菌的检查与判断,2.2.1 无菌试验,判断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据。 无菌试验的目的： 监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否彻底 监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入 了解整

5、个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角 酚红肉汤培养检查：配方：0.3%牛肉膏、0.5%葡萄糖、0.5%氯化钠、0.8%蛋白胨、0.4%的酚红溶液(pH=7.2),a.无菌肉汤培养基空培养 接入样品 培养观察 b.平板划线检查或斜面培养检查： 2.2.2显微镜检查 染色 镜检 多在染菌程度较深时，用于判断杂菌的种类，靠显微镜无法发现染菌初期的杂菌。,2.2.3 通过发酵的生理生化指标检查,除了以上的方法外，在实际生产中还可以根据以下参数的异常变化来判断是否染菌。结合计算机，建模后，可以及早发现与预测染菌。 a: 降糖速度 b: 产酸速度， pH值 c: 溶解氧 d: 光密度 e: 排气中CO2含

6、量 f: 产物含量 g: O2的消耗,2.3 各种检查方法的比较 显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜捡取样少，视野的观察面也小，因此不易检出早期杂菌。 平板划线法和肉汤培养方法的缺点是需经较长时间培养才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能检出更少的杂菌，而且结果也更为准确。,检查结果应以平板划线和肉汤培养结果为主要根据 平板划线和肉汤培养应做三个平行样 要定期取样 酚红肉汤和平板划线培养样品应保存至放罐后12小时，确定为无菌时方可弃去,3 污染杂菌的原因分析,3.1发酵染菌率 总染菌率：指一年内发酵染菌的批次与总投料批次数之比。 设备染菌率：统计发酵罐或其他设备的染菌率，

7、有利于查找因设备缺陷而造成的染菌原因 不同品种发酵的染菌率：统计不同品种发酵的染菌率，有助于查找不同品种发酵染菌的原因,不同发酵阶段的染菌率：将整个发酵周期分成前期、中期和后期三个阶段，分别统计其染菌率。有助于查找染菌的原因。 季节染菌率：统计不同季节的染菌率，可以采取相应的措施制服染菌。 操作染菌率：统计操作工的染菌率，一方面可以分析染菌原因，另一方面可以考核操作工的灭菌操作技术水平。,3.2 染菌原因的分析,原因的分析是为了今后的预防，是积极防范的措施。 避免在发酵生产中污染杂菌应以预防为主。“防重于治”，事前防止胜于事后挽救。 如果一旦发生染菌现象就要尽快找出原因及时纠正、堵塞漏洞才能减

8、少损失，并从中吸取经验教训，避免以后有类似情况发生，保持生产的正常进行。,3.2.1从染菌的规模来分析染菌原因 大批发酵罐染菌 ：空气系统 部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的 个别发酵罐连续染菌和偶然染菌 ：设备问题,3.2.2从染菌的时间分析 a.发酵早期染菌 可能是从种子中带入，或由于培养基灭菌不彻底，或设备有“死角”，清洗不干净而染菌。 b.发酵中后期染菌 可能是无菌空气或中间补料带入杂菌，或发酵设备渗漏，以及操作不合理逐渐侵入杂菌而造成的。,耐热性芽孢杆菌：可能是由于原料中原有的芽孢未能杀灭，或者死角或灭

9、菌不彻底。 球菌、酵母：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的，或者设备渗漏。 浅绿色菌落(革兰氏阴性杆菌、球菌) ：发酵罐的冷却管或夹套渗漏 霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格 噬菌体：很可能是空气系统，种子污染。,3.2.3从染菌的类型来分析,4 发酵染菌的预防,4.1原料染菌的防治 对于液体原料：采用连消方式 对颗粒状淀粉质原料或者小发酵罐，采用实消为好。而且升温时需搅拌，或加入-淀粉酶。,4.2种子带菌的防止,带菌的原因： 无菌室的无菌条件不符合要求 培养基灭菌不彻底 操作不当 种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂

10、菌。种子培养的设备和装置有无菌室、灭菌锅和摇瓶机等。,4.2.1无菌室的基本要求： 无菌室面积不宜过大，一般约46米2高约2.6米。 为了减少外界空气的侵入，无菌室要有13个套间(缓冲过道) 无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求无裂缝，墙角最好做成圆弧形 。 室内布置应尽量简单，最好能安装空气调节装置，通入无菌空气并调节室内的温湿度。 无菌室的每个套间一般都用紫外线灭菌。,4.2.2种子培养基灭菌的注意事项,灭菌操作时需要注意排气管是否畅通 固体培养基可采用两次灭菌的方法 4.2.3种子摇瓶培养的注意事项 保证摇瓶间的清洁卫生 摇瓶内液体装料不宜过多 瓶口包扎的纱布一般为八层以

11、上,对种子培养基的染菌的处理： 一般均应灭菌后坚决弃去，并对接触过的设备，管道全部灭菌，加长灭菌时间等。,4.3 空气带菌的防治 空气冷却器的列管穿孔泄露，冷却水会渗入到空气中，造成染菌。 棉花-活性炭过滤器长期使用后，棉花和活性炭的体积被压缩而松动，如果上下端棉花铺得厚薄不均，厚的一边阻力大空气不畅通，薄的一边空气容易通过，久而久之，薄的一边长期受空气顶吹而使棉花活性炭改变位置，造成过滤器失效。 过滤器用蒸汽灭菌时，若被蒸汽冷凝水润湿就会降低或丧失过滤效能，灭菌完毕应立即缓慢通入压缩空气，将水分吹干。,超细纤维纸作过滤介质，灭菌时必须将管道中冷凝水放干净，以免介质受潮失效。 在生产实践中，空

12、气管道大多与其它物料管道相接，要装上止逆阀防止其它物料窜入空气管道污染过滤器，导致过滤介质失效。 记录过滤介质的使用时间，适时更换。,4.4 发酵设备带菌的防治,对于设备的灭菌主要是为了避免“死角”和渗漏。 4.4.1常见的“死角” a.法兰连接的死角 发酵工厂的有关管路要保持光滑、通畅、密封性好，以避免和减少管道染菌的机会。,由宁 法兰,b.渣滓在罐底与用环式空气分布管所形成的死角,c.不锈钢衬里的死角 操作时要注意避免罐内发生真空现象。采用复合钢板(将两种不同材质的钢板轧合为一体的钢板)制造发酵罐，因为两层钢板紧密结合在一起，中间没有空隙，所以不会产生上述问题，是一种理想的材料。,d.接种

13、管路的死角,4.4.2渗漏 设备和管件的渗漏一般是指设备和管件由于腐蚀、内应力 或其他原因形成微小漏孔所发生的渗漏现象。这些漏孔很小，特别是不锈钢材料形成的漏孔更小，有时肉眼不能直接觉察，需要通过一定的试漏方法才能发现。,a.设备渗漏的原因 发酵液中腐蚀性物质对设备的腐蚀磨蚀. 发酵液中固体物料因搅拌桨的搅动与冷却管摩擦而引起 管外壁磨损. 冷却介质和加热时蒸汽的冲击，引起管内壁的磨损. 设备加工不良 弯管时，弯头处管壁变薄 焊接不良,b.盘管渗漏的防止 放罐后要认真清洗发酵罐 控制冷却水质量，降低其中氯离子含量 对盘管定期检查、试漏，及时发现漏隙 空气分布管渗漏的防止,C.管件的渗漏防止 与

14、发酵罐相连接的管路很多，有空气、蒸汽、水、 物料、排气、排污等管路，管路多，相应的管件和 阀门也多。管道的连接方式、按装方法以及选用的 阀门形式对防止污染有很大的关系。所以，与发酵 有关的管路、阀门不能同一般化工厂的化工管路完全 一样，而有其特殊的要求。,4.5 操作不当导致染菌的防止,为防止染菌，有关人员要严格按规程操作，特别是补料、取样、接种等。对罐压力的降低，泡沫顶盖，发酵液倒流过滤器等情况应严格操作与管理。,5、发酵染菌后的措施 种子培养或种子罐中发现污染及时倒罐，清洗。 发酵早期染菌可以适当添加营养物质，重新灭菌后再接种发酵。 中后期染菌可以加抗生素或正常发酵液，降低温度、降低通风量、停止搅拌等措施。对于发酵后期产物已积累到一定浓度应该提早放罐。,噬菌体污染的措施： 重消法、轮换菌种法、并罐法等措施凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。染菌严重时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，罐内、空气必须用甲醛蒸汽消毒。,