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1、水微生物检测,南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心,教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生 实验课时：8学时 课程类型：专业实验课 课程要求：必修 每组人数：2人,实验目的与要求,掌握水样采集规则及注意事项。 熟悉常用水卫生细菌学指标。 熟悉菌落总数、大肠菌群的测定方法及检测意义。 学会对所检测的水样作综合分析。,水微生物检测的意义,水体的微生物污染问题日趋严重。 在各种水体，特别是污染水体中存在有大量的有机物质，适于各种微生物的生长。 水体中微生物污染的来源：土壤，以及人类、动物的排泄物污染。 水体中少数致病微生物（主要来自人或动物的粪便污染）可导致某些肠道传染病传播。 水微生物检测可用于
2、评价水质情况，预报水质的污染趋势，以保证水质的卫生安全。,在实际工作中，对水质卫生质量的评价和控制，是无法对水体中各种可能存在的致病微生物一一进行检测。 一般选择有代表性的一种或一类微生物作为指示菌，通过对指示菌的检测，来了解水体是否受到过的微生物污染，是否有肠道病原微生物存在的可能。,水微生物的检测指标,菌落总数(aerobic bacterial count) 是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。 检测意义：作为一般性污染的指标，即评价被检样品的微生物污染程度和安全性。水样菌落总数越多，说明水被微生物污染程度越严重，病原微生物存在的可能性越大，但
3、不能说明污染的来源。,水质微生物的检测指标,总大肠菌群(coliform bacteria) 是指一群需氧及兼性厌氧的，37生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 检测意义：作为粪便污染的指标。水样总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能。,实验内容,水样采集； 菌落总数的测定； 总大肠菌群的测定。,一、水样采集,采样原则 所采集的样品具有代表性。 采样容器：选择硼硅玻璃瓶和聚乙烯塑料瓶。 不能是新的污染源；不吸收或吸附某些待测组分；不与待测组分发生反应。保证从采样到分析期间，样品各组分的浓度不发生改变。 必须按一般无菌操作的基本
4、要求采集，并保证在运送、贮存过程中不受污染。,自来水水样：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5 min（经常用水的水龙头放水13min）后，采集水样于无菌锥形瓶，约占瓶容量80%，以便摇匀水样。 水源水水样：选有代表性的地点及可疑地方，一般距水面下1015cm采样。采样后，将瓶塞盖好，再从水中取出。,注意事项 严格无菌操作。 做好标记：采得水样后应立即记录水样名称、地点、时间等项目。 从速送检。水样从采集到检验不应超过2h，在04下保存不应超过24h。,二、菌落总数的测定, 平板菌落计数法,（一）生活饮用水,器材与试剂 无菌1ml吸管1支/组，无菌平皿3个/组，营养琼脂。
5、,方法 水样摇匀2025次，使细菌分散。 倾注培养：无菌吸取1ml水样分别置于2个空平皿，另一个作空白对照。再倾注15ml琼脂（约45）于平皿中旋转，混匀待琼脂凝固后倒置3724h。 菌落计数：用肉眼或放大镜检查，计数平皿内菌落数目。,结果分析与报告 计算平均菌落数： 报告方式：菌落总数(cfu/ml)。 cfu：colony forming units 当检样的菌落数为l100时，按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字报告。 国家标准（GB5749-2006）规定生活饮用水菌落总数每毫升不得超过100个。,（二）水源水,器材与试剂 无菌1ml吸管6支/组，无菌10ml吸管1支/组。 无
6、菌平皿9个/组，营养琼脂。 90ml灭菌盐水1瓶（内置适量玻璃珠），9ml灭菌盐水管3支。,方法 稀释水样： 无菌吸10ml混匀水样注入90ml灭菌水瓶中,混匀成1:10水样。 取1:10水样1ml注入9ml灭菌试管中混匀成1:100水样。同法稀释成1:1000, 1:10000水样。,方法 倾注培养： 用1ml无菌吸管吸取23个适当浓度的稀释液1ml,分别注入无菌平皿中，每个稀释度应同时做2个平皿，另取一平皿作空白对照。再做倾注培养(方法同饮用水)。 菌落计数：方法同饮用水。,菌落总数测定,结果分析与报告 计算不同稀释度的平均菌落数： 稀释度的选择和菌落总数报告方式： 首先选择平均菌落在30
7、300之间者进行计算。 计算方法和报告方式如表1所示。,表1稀释度选择及菌落总数报告方式,由表2可判定水质被污染的程度。 表2 一般水源水中菌落总数与水清洁程度的关系,注意事项 菌落总数测定中，应选择合适的稀释度进行。（生活饮用水，国家标准规定每毫升不得超过100个，因此可以直接吸取1毫升到平板进行培养） 各稀释管、相应平皿做好标记。包括：水样名称、稀释度、时间、小组。 严格无菌操作。进行水样稀释时，每一稀释度均需更换吸管。 倾注时，要注意营养琼脂的温度。 倾入琼脂后要混匀，待琼脂凝固后倒置培养。,三、总大肠菌群的测定多管发酵法,分为三步： 初发酵试验 平板分离 复发酵证实试验,初发酵试验：采
8、用乳糖蛋白胨培养液37培养24h，观察产酸产气情况。 平板分离：对阳性管培养物，接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基，观察菌落特征，并进行革兰氏染色和镜检。 复发酵证实试验：对典型和可疑菌落，接种于乳糖蛋白胨培养液，进行复发酵证实试验，并根据标准所附检数表报告结果。,产气,初发酵、复发酵试验结果,大肠菌群EMB上菌落特征,大肠菌群革兰染色形态,（一）生活饮用水,器材与试剂 2瓶50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液（内有导管）, 10支5ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液（内有导管）,10ml吸管1支,100ml量筒1支。 EMB，革兰染液等。,方法 初步发酵试验：接种水样总量为300ml（100
9、ml 2份，10ml 10 份，12支发酵管） 。37培养24h。 平板分离：将产酸产气及只产酸不产气(发酵乳糖)管接种EMB, 37培养24h，取典型菌落作革兰氏染色镜检。 复发酵试验：革兰氏染色镜检为革兰阴性无芽胞杆菌，取该菌接种于普通浓度乳糖蛋白胨(每管接13个菌落), 37培养24h，有产酸产气者即证明有大肠杆菌的存在。,产酸产气,报告为大肠菌群阳性,结果分析与报告 根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数，查接种水样总量为300ml检数表（表3）。 报告每升水样中的大肠菌群数（MPN 值，Most Probable Number，最大可能数法）。 国家标准（GB5749-2006）规定
10、生活饮用水大肠菌数每升不得超过3个。,表3 大肠菌群数检数表接种水样总量300ml（100ml 2份，10ml 10 份）,（二）水源水,器材与试剂 1ml吸管3支/组，10ml吸管1支/组，10ml普通发酵管（内有导管）3支/组，5ml三倍发酵管（内有导管）1支/组。 EMB，革兰染液等。,方法 稀释水样：水样做1:10及1:100稀释。方法同菌落总数测定。 初发酵试验：接种水样总量11.11ml， 4支发酵管。取10ml原水样注入5ml三倍乳糖发酵管（内有导管）；取1ml原水样、1ml 1:10及1:100稀释水样分别注入10ml普通乳糖发酵管（内有导管），37培养24h。 平板分离与复发
11、酵试验：同生活饮用水。,结果分析与报告 根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数，查接种水样总量为11.11ml检数表（表4），报告每升水样中的大肠菌群数。,表4 大肠菌群数检数表接种水样总量11.11ml（10ml、1ml 、0.1ml、0.01ml 各1份）,注意事项 总大肠菌群的测定方法，由于饮用水和水源水可能的污染程度不同，因些采用不同的接种量，检数表也不相同。 当接种量超过1毫升时，一般采用多倍浓度培养液。如配制3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液50mL，加入100mL水样后，总体积为150mL，培养液恢复到正常浓度。 做好标记。 严格无菌操作。每一稀释度均需更换吸管。,实验安排,当日：水样采集、倾注培养、初发酵试验。 第二日：菌落计数及结果报告、平板分离。 第三日：涂片，革兰氏染色，镜检、复发酵试验。 第四日：报告大肠菌群数。实验报告，并对所检测的水样进行综合分析。,
