《{城乡园林规划}第十七章细胞工程胡以平)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《{城乡园林规划}第十七章细胞工程胡以平)（99页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第十七章 细胞工程 （cell engineering）,第一节 概述 第二节 动物细胞工程涉及的主要技术 第三节 动物细胞工程的应,内 容,第一节 概 述,是在细胞水平上，采用细胞生物学、发育生物学、遗传学及分子生物学等学科的理论与方法，按照人们的需要和设计对细胞的遗传性状进行人为修饰，以获得具有产业化价值或其他利用价值的细胞或细胞相关产品的综合技术体系，也称细胞技术。细胞工程是现代生物技术（biotechnology）的基本组成部分之一。,一、细胞工程（cell engineering）,是指应用生命科学和工程学的基本原理及其相关技术，对微生物、动物或植物等有机体进行人工操作或改造，以实现
2、人类某些特殊需求的综合性技术体系。又称生物工程（bioengineering）。,二、生物技术（biotechnology）,旧石器时代，神农氏传授种植谷物的方法。 新石器时代，利用谷物造酒，世界上最早的发酵技术。 周代后期，豆腐、酱油和醋的制作技术，沿用至今。 公元10世纪，开始使用预防天花的活疫苗，并在人群中广泛接种，以后通过丝绸之路传至欧洲。,三、生物技术发展简史 中国,三、生物技术发展简史 西方,公元前6000年前，苏美尼尔人和巴比伦人已开始制作啤酒。 公元前4000年前，埃及人开始制作面包。 1860年，巴斯德单一霉菌纯粹培养技术。 1878年，啤酒酵母单一培养技术。 1881年，细
3、菌的纯粹培养技术。 1929年，青霉素发现。 1946年，用细菌生产出氨基酸。,1952年，用微生物转化荷尔蒙获得成功。 1953年，沃森和克里克提出了DNA双螺旋结构。 1972年，美国斯坦福大学构建了第一个重组DNA分子。 1977年，在美国旧金山建立了世界上第一家遗传工程公司。,传统生物技术（traditional biotechnology）：旧时期的制造酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶及其他食物的传统工艺。 现代生物技术（modern biotechnology）： 上世纪新出现的各种生物技术。,四、生物技术分类,基因技术基因工程 细胞技术细胞工程 基因酶技术酶工程 发酵技术发酵工程 蛋
4、白质技术蛋白质工程,五、现代生物技术的五大体系,六、现代生物技术的安全性与伦理问题,转基因是否会破坏重要生长基因或激活癌基因？ 生物武器？ 环境危害？ 克隆人问题？ 基因诊断是否会侵犯人类隐私权？ 宗教问题？ 动物保护问题？ 重要生物技术的垄断？ ,第二节 动物细胞工程涉及的主要技术,细胞工程,微生物细胞工程,植物细胞工程,动物细胞工程,动物细胞工程所涉及的研究领域,生产医用蛋白 生产基因工程动物 核移植与动物克隆 组织工程 细胞治疗,一、大规模细胞培养 （large-scale cell culture）,是在人工条件下（设定pH、温度、氧溶等），高密度大规模的在生物反应器（bioreact
5、or）中培养细胞用于生产生物产品的技术，它是细胞工程的重要组成部分。,（一）大规模细胞培养的原则,1、增加培养容积 2、增大细胞的附着面积 3、抑制细胞凋亡 4、无血清培养,首要考虑因素 培养的容积越大，细胞的产量就越高 是提高悬浮生长细胞产量的最重要因素,1、增加培养容积,提高细胞产量的另一个重要因素 培养容器中添加细胞附着生长的支持物 常用的支持物主要有： 微载体（microcarrier） 中空纤维（hollow fiber） 微胶囊（microcapsule）,2、增大细胞的附着面积,高分子微细实心颗粒，100300m 集单层培养和悬浮培养的特点于一体 增大细胞附着面积十分明显,（1）
6、微载体（microcarrier）,HEK 292 cells on microcarriers infected with Adenovirus with GFP marker,Glass Ball Spinner System,Cells on microcarrier,GCS technology enables life science researchers to mimic in vivo morphology in an in vitro environment,半透膜性两端开口的中空纤维，直径约200m 细胞附着于外表面，内部有培养液通过 利于分泌型表达蛋白的纯化，不易放大培养
7、,（2）中空纤维（hollow fiber ）,Cross-section through hollow fiber culture system showing extracapillary space,Hollow Fiber Cell Culture System,半透性膜所围成的囊，直径200m左右 细胞生长在囊的内壁 细胞密度大(108/ml), 产物浓度高, 分离纯化相对简单 需研究人员自行制备,（3）微胶囊（microcapsule）,Fluorescence microscopy image of FITC-peroxides loaded polypeptide microc
8、apsules,A scanning electron microscope image of a fractured microcapsule, once filled with healing agent,3、抑制细胞凋亡,培养的后期，维持细胞的高活力是关键 细胞凋亡是大规模培养时细胞死亡的主要原因 细胞静止（cell rest）技术可以有效降低营养成分消耗和代谢毒物产生，对提高培养细胞表达目的蛋白的产率是一种有效的手段,4、无血清培养,血清培养基与无血清培养基的比较,（二）大规模细胞培养系统,1.悬浮培养系统 2.气流驱动培养系统 3.微载体培养系统 4.灌注培养系统,1.悬浮培养系统（
9、suspension culture system）,细胞产量是最高的 仅适合于悬浮生长细胞,旋转细胞培养系统（Rotary Cell Culture System , RCCS）,2.气流驱动培养系统（airlift culture system）,被成功培养的细胞有：HeLa、BHK21、人类原始淋巴细胞以及植物细胞等 凡适合于在搅拌悬浮培养体系中生长的细胞都可以在本培养体系中生长，如用于制备单克隆抗体的杂交瘤细胞 不需要发动机和搅拌装置,3.微载体培养系统（microcarrier culture system）,微载体与搅拌悬浮培养相结合的一种培养体系 适于贴壁生长细胞的大规模培养 微
10、载体培养技术复杂,4.灌注培养系统（perfusion culture system）,可使细胞始终处于一个较好的营养状态和生存环境 可以在 “旧”培养基中连续收集培养细胞所分泌的某些产物 可以根据特殊的要求，通过改变培养液的组成实现对于细胞状态的人为调控,A,B,C,D,A,B,C,D,（三）影响细胞生长的因素,1.量化评估大规模培养细胞的营养需求 2.探索大规模培养细胞合适的生存环境 3.鉴定细胞的健康状况,二、核移植（nuclear transfer）,是指利用显微注射装置，将一个细胞的核植入于另一个已经去核的细胞中，以得到重组细胞的技术。通常所说的核移植，则是指将一个二倍体的细胞核植入
11、于另一个已经去核的细胞（受精卵或处于M期的卵母细胞）中，以得到重组细胞，并使其在一定环境中生长发育，最后获得新的个体的综合技术体系。,去/取核（A/B）-新核/移入（C/D）,（一）核移植技术的基本技术流程,1受体细胞的选择 早期多采用受精卵（合子）细胞作为受体细胞，后发现处于M II期的卵母细胞更适合作受体细胞。 受精卵及处于M II期卵母细胞的细胞质，可使所植入的细胞核基因组的发生重编程（reprogramming），以致处于不同分化程度的供核细胞得以去分化、恢复到全能性状态。由此获得的重构卵，进入到正常的发育程序，从而获得遗传背景完全源于供核细胞的动物个体。,2供核细胞的选择 供体细胞主
12、要有两大类：早期采用胚胎细胞作为供核细胞。现已知，未分化的原始生殖细胞（PGCs）与胚胎干细胞（ES细胞）、胎儿体细胞、成年体细胞甚至是高度分化的神经细胞、淋巴细胞等均可作为供核细胞的来源。 对不同供核细胞来源的克隆研究结果表明，克隆效率一般随其供核细胞分化程度的提高而下降。,3去核 细胞核移植能否成功的关键与前提。 目前的去核方法主要有以下几种： （1）紫外线照射去核 （2）盲吸法去核 （3） 蔗糖高渗处理去核法 （4）透明带打孔去核法 （5）超速离心法,4重构胚的组建 通常做法：采用显微操作，直接将供核细胞移植到已去核的MII期卵母细胞（或受精卵）的透明带下，然后通过细胞融合（电融合或仙台
13、病毒介导），使供核细胞与受体细胞发生融合，实现细胞核与细胞质的重组。存在问题：供核细胞质参与重构胚，这有可能导致克隆动物组织细胞中线粒体的多样性。 另一种做法：以显微针抽吸供核细胞，分离出其细胞，然后将核直接注入已去核的受体细胞中，直接构成重组胚，该法主要被用于克隆小鼠的制作。,5重构胚的激活 正常受精过程中，会发生一系列的精子激活卵母细胞的事件。因而，在重构胚组合成功后，也必须要模拟体内的自然受精过程，对重构胚施以激活。 激活通常采用化学激活与电激活方法。 激活处理后的重构胚，继续培养后，能够卵裂的，表明重构胚已激活。否则，则激活失败。,6重构胚的培养与移植 重构胚激活后，需经一定时间的体外
14、培养，或放入中间受体动物（家兔、山羊等）的输卵管内孵育培养数日，待获得发育的重构胚（囊胚或桑椹胚）后，方可将之移植至受体的子宫里，经妊娠、分娩获得克隆个体。,（二）核移植技术可使用不同的供核细胞,胚胎细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易 成体细胞核移植：细胞分化程度高，恢复全能性不容易,1938年，Spemann，两栖类动物细胞核移植。 1952年，Briggs和King，青蛙细胞核移植。 1963年，童第周，金鱼等鱼类核移植成功。 1981年，Illmensee和Hoppe，哺乳动物克隆试验。 1983年，Solter 和McGrath，小鼠胚胎细胞和内细胞团细胞为供核细胞获得克隆后代
15、。 1984年， Willadsen，世界上第一只以未分化的胚胎细胞为供核细胞的核移植绵羊。 1995年7月，Wilmut等，已分化的胚胎细胞作为供核细胞，克隆了Megan和Morag。,1胚胎细胞核移植,克隆羊Megan和Morag,1962年，Gorden，紫外线照射方法，非洲爪蟾的未受精的卵细胞的核失活，同种爪蟾的小肠上皮细胞的核植入其中，结果约1的重组卵发育为成熟的爪蟾。这一成功，标志着由体细胞核培育动物的技术体系在两栖类获得了成功。 1997年2月23日，Wilmut等，乳腺细胞作为供核细胞，成功地培育了克隆羊“多莉”（Dolly）。 1997年7月，Wilmut等，以培养的皮肤成纤
16、维细胞为供核细胞，成功地培育了克隆羊“Polly” 。,2成体细胞核移植,这一成果的重要生物学意义：,它证明了一个已完全分化的动物体细胞仍然保持着胚胎细胞的全部遗传信息，并且经此技术处理后，体细胞恢复了失去的全能性形成完整个体。 它的成功提示我们可以按照人的意志去改选、生产物种。 多利羊的诞生及生长表明，利用克隆技术复制哺乳类动物的最后技术障碍已被突破，在理论上已成为可能。,Dolly as a lamb with her surrogate mother,Dolly, first mammal cloned from an adult cell,Dolly, as an adult,Cat clone,Donor Surrogate mother with clone (Cc),Out of 87 implants only Cc survived to birth,Cc as an adult Epigenetics,Piglets clones created by PLL Therapeutics in 2000 The pigle
