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1、第五章,植物无性系的快速繁殖,植物无性系的快速繁殖,分五个阶段： 第一阶段，无菌培养物的建立 （外植体的建立） 第二阶段，诱导外植体生长与分化 第三阶段，试管苗的增殖和继代培养 第四阶段，壮苗与生根 第五阶段，小植株的移栽驯化,无菌培养物的建立,植物材料的准备 源植物的预处理 植物材料的采集 植物材料的消毒 无菌操作 初代培养物 初代培养建立起来的条件 初代培养中易出现的问题及对策,源植物的预处理,为获得健康、无菌的植物材料，需要在材料采集之前进行预处理，即将源植株栽培在特殊管理的大田或温室，或进行室内盆栽 如果必须从大田中采集植物材料，则须做到 采集未休眠或绽放前带芽鳞的芽 用塑料布包裹将用
2、的茎段或植物体部分，待长成后采集 用最幼嫩的枝条 将枝条采回后用流水冲洗。,植物材料的采集,选择植物材料应遵循的原则： 1、外植体再生能力强； 2、遗传稳定性好； 3、外植体来源丰富； 4、外植体灭菌容易。,植物材料的采集,植物材料的采集要考虑 消毒的难易程度 天气、季节、生长环境、生长状态、取材部位等 培养目的 组织培养中的反应性 即植物材料自身因素对培养中生长和发育的影响，也就是培养的难易程度,培养目的,从培养目的讲 苗木快速无性繁殖：多采用腋芽茎段、原球茎或茎尖（分生组织）作起始培养材料 生产单倍体植株：多采用花粉(药)培养或未受精胚珠培养 生产植物次生代谢物：常用活体中该天然物质含量最
3、丰富的部位游离的细胞作起始培养材料,组织培养中的反应性,基因型 源植株年龄 组织或器官的年龄 生理状态 健康状态 取材季节 生长条件 取材位置 外植体大小 损伤 外植体的极性和接种方法 预处理,基因型,双子叶植物常比单子叶植物容易获得再生植株，而裸子植物的再生能力则非常有限 同属不同种，甚至同种不同品种，器官分化和植株再生能力也有很大的差异,源植株年龄,植物的胚性组织常具有较高的再生能力 随着植物年龄的增加，其再生能力会随之而下降 植物组织培养常选用幼龄植物的组织或器官作外植体,组织或器官的年龄,幼嫩柔软(非木质化)组织一般比年老的木质化的组织更易于组织培养 在开花期，植物的再生能力都得到提高
4、,生理状态,外植体的生理状态显著影响着细胞分裂状态 一般而言，处于植物营养生长状态的外植体比生殖生长时具有更强的再生能力,健康状态,从健康的植株上取材，培养成功的可能性显然远远大于不健康的植株。 在为营养繁殖选取外植体时，源植株的健康状态对消毒的难易程度、培养的难易程度及再生植株的表现都有很大影响，所以要慎之又慎。,取材季节,从大田栽培或野生的植物上采集外植体时，要考虑取材时的季节因素 冬季是否严寒(严寒有利于打破休眠) 夏季是否干燥(水分供应不充足，就生长得差) 生长季节是否光照充足(光照不足，营养物质贮备较少),生长条件,自然昼长和自然光照条件下生长的植物材料同温室中甚至试管中离体培养的植
5、物的培养反应有所不同 与大田植物相比，生长在温室中的植物更易伸长和黄化，在培养中也更容易再生,取材位置,从树体上游分离外植体时，位置越靠上，不定根发生的可能性就越小，这是由于上部要比下部更为成熟 按照植物生理学的观点，沿植物主轴，愈向上生长时间愈短，但其生理或发育特性则愈近发育成熟，也就愈可能形成花器官；而愈靠近下部则愈近发育上的幼态，不定根发生能力也愈强,外植体大小,离体部分愈大，就愈易诱导其生长和再生，同时添加的营养和植物生长调节物质的依赖性也有所下降 分生组织越大，存活率越高，却对于脱除病毒不利，外植体愈小的旺盛生长的分生组织区域，病毒含量就越小或无，脱除病毒的机会也就越大 切取大小不同
6、的伤口面积同无损伤部分的比例也应加以考虑，因为它会影响到再生能力,损伤,损伤组织对培养反应影响大，因为损伤区域可以扩大对营养物质和生长调节物质的吸收，同时也增加乙烯的产生,外植体的极性和接种方法,外植体的极性也显著影响着培养中的反应，极性同某些生理活性物质的浓度梯度有关 外植体的接种方式有两种：有时极性方式直立，非极性方式倒置。有时非极性接种方式根和芽再生比极性接种方式更容易，也更快,预处理,原初外植体可通过预处理来改变其生理状态 低温处理 将外植体置于一定的溶液中(含糖、BA、GA3等或不同浓度的BA) 利用注射的方法注入生长调节物质,植物材料的消毒,植物材料的消毒,外植体消毒的步骤： 外植
7、体取材 自来水冲洗 70酒精表 面消毒（2060s） 无菌水冲洗 消毒剂处理 无菌水充分洗净 备用,植物材料的消毒,茎段、茎尖或叶柄、叶片表面消毒 地下根茎消毒 果实和种子消毒 花药或未授精胚珠等消毒 注：为了增强消毒效果，采用如下方法： 将植物材料在灭菌前用清洁的流水(或自来水)冲洗0.52小时 向消毒剂中加入1滴或数滴吐温(Tween)20或80，浓度为0.08一0.12，粘着剂可降低表面张力，更好地同材料表面接触 在消毒过程中搅拌或振荡 在真空中进行消毒，可使气泡排除，灭菌更有效 多种消毒剂多次消毒处理或复合消毒处理,无菌操作,无菌操作室或接种室消毒 工作人员的个人清洁卫生 接种工作台、
8、接种工具、容器等的消毒 接种操作要领,初代培养建立起来的条件,保证无菌 条件合适 选择好合适的作物种类、品种及培养的部位 选择好合适的培养基，激素及其他添加物 掌握适宜的培养条件 技术过关,初代培养中易出现的问题及对策,污染 操作污染分为细菌污染和真菌污染 外植体自身带菌导致的污染 由于表面灭菌不彻底或外植体内部带菌所致 褐变 褐变的概念及影响因素 褐变的防止方法,细菌污染,细菌污染 表现：在培养过程中，在培养基表面或材料表面出现黏液状物体、菌落或浑浊的水迹状，有时甚至出现泡沫发酵状。 原因：主要是由于工作人员使用未经充分消毒的工具、或由于呼吸排除的细菌、或操作人员用手接触材料或器皿的边缘，使
9、微生物落入培养基中，有时也会因剪取某一带菌材料后用具又未彻底灭菌，造成继续污染。,真菌污染,真菌污染 表现：在培养过程中，一般35天发现菌丝，既而很快出现灰、白、黄、绿等孢子。 原因：空气污染以及取放瓶塞扬起的灰尘和真菌孢子落入器皿中造成。,褐变的概念及影响因素,概念 褐变是指培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基和培养材料逐渐变褐而死亡的现象。 褐化的发生是由于组织中多酚氧化酶被激活，酚类化合物被氧化形成褐色的醌类物质。醌类化合物在酪氨酸酶的作用下，与培养材料组织中蛋白质发生聚合，引起其它酶系统失活，导致代谢紊乱，生长受阻。 影响因素 基因型 材料的生理状态 培养基成分 培养时间,褐变的
10、防止方法,选择适当的外植体，掌握适宜的采芽时间 外植体用流水冲洗30分钟以上，在接种前将外植体在无菌水中浸泡处理 降低对外植体的切割损伤，或在无菌水中切割 降低培养基中无机盐浓度；缺省生长调节物质可减少酮类物质分泌和氧化 使用液体培养基可以迅速稀释外植体伤口处分泌出的有毒物质 在培养基中加入活性炭 在培养基中加入聚乙烯吡咯烷酮PVP 加入抗氧化剂如柠檬酸、维生素C、L半胱氨酸、硫脲 在培养基中添加氨基酸(谷酰胺、精氨酸、天冬酰胺)、芳香甙、硫代硫酸钠 连续转接到新鲜的培养基上有时可缓慢阻止色素的形成 由苗芽基部光激活引起的褐化可通过将苗芽基部处于黑暗状态得以消除 控制光温条件，避免过高,诱导外
11、植体生长与分化,再分化过程的类型大体上可分为以下几类 顶芽和腋芽的发育 不定芽的发育 体细胞胚状体的发生与发育 原球茎的发育 原球茎是一种类胚组织，可理解为缩短的、呈珠粒状的，由胚性细组成的类似嫩茎的器官。大部分兰花的培养属于这一类型,顶芽和腋芽的发育,顶芽和腋芽的发育方式主要有以下两种 无菌短枝型：又称节培法，或微型扦插法，是将待繁殖的材料，剪成单芽茎段，转入成苗培养基，一定时间后可成苗，再剪成单芽茎段，继代又可成苗（图）。 丛生芽增殖型：茎尖或带芽茎段在外源细胞分裂素的作用下会使休眠芽启动生长，形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状结构（图）。 注：通过顶芽和腋芽发育再生植株这种方法为多数园艺
12、家们所推崇，它不经过发生愈伤组织而再生，是最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式,不定芽的发育,有两种情况 一种是不定芽的产生不经过愈伤组织阶段，不定芽是从外植体受伤或没有受伤的部位直接分化出来，这种植株的再生方式，称器官型。 另一种是不定芽的产生要经过愈伤组织阶段，即从外植体上诱导出愈伤组织，从愈伤组织上产生不定芽的再生方式，称器官发生型。 注：通过这种方式繁殖，繁殖率极高，同时也可创造有益的突变体。但极易发生变异，常常不能保持优良品种的遗传特性，在快繁中一般要避免此种器官发生方式。,试管苗的增殖和继代培养,植物材料在容器中培养一段时间后，往往需要转接到新鲜的培养基上去生长。因为： 培
13、养基消耗尽 植物材料在培养容器中已占尽生长空间 需进一步增殖(转到同样配方的培养基上) 植物材料转入下一阶段生长或另一种器官分化(转到不同配方的培养基上) 由于无机盐和琼脂浓度过高而导致培养基干化 由于pH值下降而引起培养基流体化 防止褐化现象发生而转接,试管苗的增殖和继代培养,继代培养中易出现的问题 玻璃化现象 驯化作用 试管繁殖速率及其计算,试管苗的增殖和继代培养,试管苗继代培养过程中分化再生能力衰退 原因：1、愈伤组织培养逐渐丧失了成器官中心；2、内源激素的减少；3、染色体畸变。 解决措施：增加外源生长调节物质；筛选具有形态分生能力细胞团；缩短继代时间；重新建立细胞系。 影响试管苗继代培
14、养的因素 植物材料的影响 培养基及培养条件 继代培养时间长短 季节的影响 解决措施,培养产物的观察记载（P56）,1、愈伤组织诱导率（产生愈伤组织的外植体数/外植体总数）100% 愈伤组织生长量培养一定时间后愈伤组织干重或鲜重接种时愈伤组织干重或鲜重 2、胚状体诱导率（产生胚状体的外植体数/外植体总数）100% 3、芽分化率（产生芽的外植体数/外植体总数） 100% 4、发根率（发根芽数/培养芽数）100%,玻璃化现象,玻璃化现象(vitrification) 是一种异常的生理现象。 玻璃化苗是植物组织培养时出现的半透明状、畸形的试管苗 其解剖特点为：整株植物矮小肿胀，呈半透明状。有时发育出大
15、量短而粗的茎，节间很短或几乎没有节间。输导组织虽可看到，但导管和管胞木质化不完全。叶片厚而狭长，有时基部较宽。叶片皱缩或纵向卷曲，脆弱易折碎。叶表缺少角质层蜡质或蜡质发育不完全，无功能性气孔器。玻璃化叶片不具有栅栏组织，仅有海绵组织。,玻璃化现象,玻璃化现象产生的原因 一般而言，培养条件与玻璃化现象的发生有关.培养条件引起试管苗碳水化合物、氮代谢和水分状态等发生生理异常。 降低和减轻玻璃化现象采取的措施 增加琼脂和(或)糖浓度 改善培养容器的气体交换 改变培养基的大量盐类 降低BA水平 增强光照，适当降低温度 避免采用容易产生玻璃化现象的琼脂种类 采用液固两相培养基,玻璃化苗发生的机理,试管苗
16、玻璃化的产生是由于内源激素乙烯在代谢调节中所起的关键性启动作用。试管苗在胁迫培养环境中，如水势不当，通气不畅、生长调节剂浓度过高、温度过高等，导致乙烯产生。培养瓶空气中过剩的乙烯抑制了试管苗体内乙烯的生物合成，但诱发了其它激素质和量的改变及酶类的变化；另外，培养瓶中气体组成的改变，也影响磷酸戊糖途径、光呼吸途径的进行。,驯化作用,驯化作用是指原先依赖于某种生长调节物质而生长的培养物，经过一段时间的继代培养后，不再需要这种生长调节物质，即变成对该生长调节物质自养的培养物的现象 驯化作用一般并非是永久性变化，有时培养条件变化也会逆转驯化作用，所以驯化作用是外遗传变化。 驯化作用可在继代培养中自然发生，也可人为地改变培养条件，可以诱导或逆转这种驯化作用。 驯化作用可能是由于植物组织内对该生长调节物质的合成增加所致，也可能是降解速率降低或受到保护所致，组织对生长调节物质敏感性降低也可能是一种原因，也不排除上述
