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1、第五章、植物人工繁殖,植物人工繁殖 植物组织培养 人工种子 植物胚胎培养 脱毒植物培养,一、植物人工繁殖,器官形成方式,植物无性繁殖过程中器官形成方式有： 不定芽型 器官型 器官发生型 胚状体发生型 原球茎型,1、不定芽型：,诱导顶端分生组织产生不定芽，再生成植株的方式。即选取已经发育成熟的顶芽和腋芽，连同它们的短枝经表面消毒后，在无菌条件下培养，诱导不定芽并使其生根形成植株的方式。 只要有明显的顶端分生组织和次生分生组织的植物均适用。 特点：不仅繁殖率高，利用外植体原有的芽，包括隐芽在内繁殖数量大，同时能保持该物种的遗传稳定性。,不定芽型,2、器官型：,从器官外植体诱导不定芽 ，再生成植株的
2、方式。即选取充分发育的器官诸如茎、叶、花器、鳞片等，经离体培养而产生植株的方式。 如烟草、大蒜、甘蓝的花茎培养诱导不定芽；水仙、百合、风信子、贝母的鳞片培养诱导不定芽；亚麻的下胚轴培养诱导不定芽；虎眼万年青的任何一部分均可诱导不定芽。 特点：遗传性也比较稳定，但繁殖速度慢。,3、器官发生型：,从器官外植体诱导愈伤组织，经愈伤组织细胞的分化再生成植株的方式。 例：禾本科：甘蔗、水稻、小麦，百合、小苍兰、菊花、番茄、石刁柏、柑橘、棕榈等常以器官发生型方式再生植株。 特点：繁殖速度快，由于经愈伤组织而再生植株，遗传性不稳定。,愈伤组织分化不定芽,4、胚状体发生型,由植物器官、组织和细胞培养而直接发生
3、类胚体结构，最后以胚状体成苗的方式。 在被子植物中有胚状体发生的植物已达100余种，分属近40个科。 特点：遗传性一致，有些植物体细胞发生数量也相当大。如胡罗卜1L培养基有10万个以上的胚状体。,器官发生与胚状体发生,几种器官发生方式的优点、缺点比较,（1）不定芽型容易成苗，对培养基要求不高，后代遗传性较为稳定，但取材受到一定的限制，仅限于具有明显顶端分生组织和次生分生组织的物种； （2）器官型和胚状体发生型，对培养基要求高，器官发生条件苛刻。繁殖数量不如不定芽型和器官发生型多，但遗传性稳定； （3）器官发生型成苗数量大，对培养基要求不算高，容易调配。但由于是通过愈伤组织成苗，细胞的染色体容易
4、发生数量和结构变异，很难使再生植株群体保持稳定的遗传性。,5、原球茎型,是兰属特有的器官发生方式。种子消毒后，在培养基上播种，经一段时间培养而发生原球茎，然后由原球茎直接长成植株。,原球茎分化,蝴蝶兰原球茎分化,二、植物组织培养,植物组织培养（plant tissue culture）：将植物器官、组织、细胞或原生质体等外植体材料于无菌条件下培养在人工培养基上，在适当条件下诱发长成完整植株的一种技术。,主要内容,发展历史 植物组织培养的基本步骤 植物细胞分化与脱分化 植物组织培养再生植株的途径 植物组织培养的问题分析,1、发展历史1,细胞学说 Schwann Schleiden 植物组织培养之
5、父 Haberlanclt 1902年 细胞全能性 White 1934年诱导愈伤组织。 1943年正式提出 细胞全能性 植物激素的发现 F.W.Went发现生长素 1934年 1948年，崔徴和Skoog发现激素杠杆现象 1956年，发现KT 细胞-胚状体-植株 Steward 胡萝卜 1958年,发展历史2,20世纪60年代后期，植物组织培养开始走向大规模应用阶段。 法国Morel(1952年)等以大丽花茎尖进行培养试验，得到了无病毒植株。通过原球茎途径快繁，成为“兰花工业” 1964-1966年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。
6、 1972年，Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。,2、植物组织培养的基本步骤,培养基的准备-培养材料的采集-消毒-制备外植体-接种和培养-芽和根的诱导-练苗移栽 涉及内容： 培养基及其配制 外植体的选择及处理 接种和培养（环境条件的控制） 芽和根的诱导 组培苗的练苗和移栽,（1）、培养基及其配制,基本培养基 MS, B5, HE, SH, ER, NT, KM-8P, White, N6, RM, BM, Hoagland, CPW等 完全培养基,培养基中包括植物生长所必需的16种营养元素和某些生理活性物质。,生长物质配制： IAA、IBA、G
7、A3先溶于少量95%酒精，再加水定容至一定浓度； NAA可溶于热水或少量95%酒精中，再加水定容至一定浓度 2，4-D用1MNaOH溶解后，再加水定容至一定浓度 KT和BA先溶于少量1MHCl中，再加水定容 玉米素先溶于少量95%酒精中，再加热水至一定浓度。,培养基的配制,配制母液：按顺序加药，避免沉淀； 配制培养基：琼脂、糖、大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素、调pH值,常用培养基,富盐平衡培养基：MS、LS、BL、BM、ER 高硝态氮培养基：B5、N6、SH。 中盐培养基：Nitsch、Miller、Blaydes、H 低盐培养基：White、WS、HE、HB,母液配制,母液配制顺序是
8、： 用灵敏度为0.1mg的天平称取药品。 往烧杯中加入适量蒸馏水。 将药品放入烧杯内,并用玻璃棒搅拌使其溶解,难溶时可适当加温以加速溶解。 要待一种药品完全溶解再加入下一种药品 所加入的药品应依次加入，直至药品全部加入溶解为止,定容. 母液装入相应的瓶内，特别是有机成分的母液应该放入4冰箱。,（2）、外植体的选择及处理1,选择优良的基因型 从健壮的植株上取材 选择外植体的大小 选取外植体的时间(季节因素、天气因素）,（2）、外植体的选择及处理2,取材母株的预处理 外植体休眠期的处理 外植体的消毒,外植体的消毒,第一，要选取植物组织内部无菌的材料 从健壮的植株上取材，不要取有伤口的或有病虫的材料
9、； 晴天，最好是中午或下午取材，不要在阴雨天或露水未干时取材。 第二，杀死材料表面带有的各种微生物,常用消毒剂的使用及其效果,常用的消毒剂,漂白粉：一种常用的低毒有效的消毒剂，它是由多种成分组成的复合化合物，一般含10-20%（W/V）次氯酸钙，易吸潮散失有效氯而失效，使用浓度一般为5-10%，或其饱和溶液。取出上清夜，处理材料10-30分钟，杀菌效果好，且不易伤害组织，活性氯为佳。 密封贮存，防止失效，且不能贮藏太久，特别应随配随用。,次氯酸钠：用市售的安替福民配制成含210%的次氯酸钠，一般组织浸泡1030分钟。它分解氯气起杀菌作用，很易洗除，对植物无害。,酒精：含量为70-75%的酒精，
10、具有较强的渗透力和杀菌力，生长组织只需浸10-30秒钟。常用作表面灭菌的第一步，因不能彻底杀菌，往往尚需用其他杀菌剂灭菌。,常用的消毒剂,氯化汞：一种重金属化合物，有剧毒。0.1-0.2%氯化汞是一种效果极好的杀菌剂。一般浸3-12分钟。用氯化汞消毒的材料要用无菌水反复冲洗，洗净残留的汞，否则对培养物会产生毒害作用。,接种,光照培养箱,试管苗大规模培养,愈伤组织分化不定芽,炼苗和移栽,当小苗生根成为完整的再生植株后，可以出瓶种植 由于环境有很大的改变，首先要进行炼苗，使之适应外界环境 1）开盖，保持小苗的水分供需平衡 2）放置在与种植环境相一致的光、温条件下；或降低温度，增加光照 3）防止菌类
11、滋生 一般采用三步法,金线兰移栽一周的植株,3、植物细胞分化与脱分化1,在发育过程中，具有全能性的细胞（如受精卵细胞）逐步转变成形态、结构、功能各异的组织细胞的过程，称细胞分化（cell differentiation） 机体发育的过程，实际上就是一个细胞分化的过程,植物细胞分化与脱分化2,已经分化的细胞，在一定的条件下，重新回复到原始的未分化状态，称去分化或脱分化（dedifferentiation） 愈伤组织（callus）：愈伤组织是由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。 去分化的细胞，在一定的条件下，又重新分化成各种特异性的组织细胞的过程，称再分化（rediffe
12、rentiation）,4、植物组织培养再生植株的途径,再生植株的途径 器官发生途径 体细胞胚发生途径,器官发生途径1,器官发生（organogenesis）：组织和细胞培养物形成的愈伤组织分化形成芽或根的过程。 外植体（explant）：用于离体无菌培养的离体材料称为外植体，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。用于继代培养的组织培养物切段也可称为外植体。,器官发生途径2,外植体愈伤组织植株： 启动期 愈伤组织诱导与继代培养 拟分生组织的形成 器官原基和器官的形成 器官形成有三种方式 先发芽后生根 先生根后发芽 同时生根发芽,体细胞胚发生途径,体细胞胚（somatic embryo）：又叫胚状
13、体，指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。 体细胞胚发生途径： 器官外植体直接发生途径 悬浮培养细胞发生途径 愈伤组织发生途径 单细胞发生途径：主要指小孢子或大孢子 原生质体发生途径,器官发生与胚状体发生的区别,5、植物组织培养的问题分析,玻璃化问题 褐变问题 污染问题,玻璃化及预防,植物组培玻璃化苗的叶和嫩梢呈水晶透明或半透明水渍状；整株矮化肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海绵组织。,玻璃化苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难成活，严重影响
14、组培苗繁殖率的提高。,玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化。试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。产生玻璃化苗的因素主要有激素浓度、琼脂用量、温度、离子水平、光照时间、通风条件等。,预防措施,尽管玻璃化苗的出现已成为不少快速繁殖的中的普遍现象，但目前对某些植物的玻璃化已得到有效控制。,1）.适当控制培养基中无机营养成分,大多数植物在MS培养基上生长良好，玻璃化苗的比例较低，主要是由于MS培养基的硝态氮、钙、锌、锰的含量较高的缘故。适当增加培养基中钙、锌、锰、钾、铁、铜、镁的含量，降低氮和氯元素比例，特别是降低铵态氮浓度，提高硝态氮浓度，可减少玻璃化苗的比例。,2）.适当提高培养基中蔗糖和琼脂
15、的浓度,适当提高培养基中蔗糖的含量，可降低培养基中的渗透势，减少外植体从培养基中获得过多的水分。而适当提高培养基中琼脂的含量，尤其在高温季节，可降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏，也可降低玻璃化；如将琼脂浓度提高到1.1%时，洋蓟的玻璃化苗完全消失。,3）.适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度,细胞分裂素和赤霉素可以促进芽的分化，但是为了防止玻璃化现象，应适当减少其用量，或增加生长素的比例。在继代培养时，要逐步减少细胞分裂素的含量。,4）.增加自然光照，控制光照时间,在试验中发现，玻璃苗放在自然光下几天后茎、叶变红，玻璃化逐渐消失。这是因为自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。光照时间不
16、宜太长，大多数植物以812h为宜；光照度在100018001x之间，就此可以满足植物生长的要求。,5）.控制好温度,培养温度要适宜植物的正常生长发育。如果培养室的温度过低，应采取增温措施。热击处理，可防治玻璃化的发生。如用40热击处理瑞香愈伤组织培养物可完全消除其再生苗的玻璃化，同时还能提高愈伤组织芽的分化频率。,6）.改善培养器皿的气体交换状况,如使用棉塞、滤纸片或通气好的封口膜封口。,7）.在培养基中添加其他物质,在培养基中加入间苯三酚或根皮苷或其他添加物，可有效地减轻或防治试管苗玻璃化，如用0.5mg/L多效唑或10mg/L的矮壮素可减少重瓣丝石竹试管苗玻璃化的发生。在培养基中加入0.3的活性炭可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃化有良好作用。,外植体褐变及防止,褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。,褐变的原因,影响褐
