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1、第五章、单倍体的产生,所谓单倍体，指的是具有配子体染色体组成的孢子体。单倍体在遗传研究和植物育种中的意义在于： 1在单倍体细胞中只有1个染色体组，表现型和基因型一致，一旦发生突变，无论是显性还是隐性，在当代就可表现出来，因此单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。 2在品种间杂交育种程序中，通过F1代花药培养得到单倍体植株后，经染色体加倍立即成为纯合二倍体，从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需要2个世代，和常规育种方法相比，显著缩短了育种年限。,一、花药培养的一般程序,1.取材 花药在接种之前，应预先用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗的大小、颜色
2、等外部特征之间的对应关系。一般而言，单核后期花药对培养反应较好，在烟草中，此时花蕾大约与萼片等长，水稻颖片通常达到最后大小，颜色淡绿，颖内的花药色亦淡绿。,2 .预处理,适当的预处理可以显著提高花药的愈伤组织诱导率。常用的预处理方法是低温冷藏，具体的处理温度和时间长度因物种而异：烟草 79，714 d；水稻710，1015 d；黑麦l 3，7 14d；大麦 3 7，7 14 d,3.消毒,花药适宜培养时，花蕾尚未开放，花药在花被或颖片的严密包被之中，本身处于无菌状态，因此，通常只要以70酒精喷洒或擦拭花器或包被着麦穗的叶鞘表面，即可达到灭菌要求。,4. 接种,在无菌条件下把雄蕊上的花药轻轻地从
3、花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养，在整个操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体愈伤组织。 如果所碰到的是花器很小的植物，如天门冬属、芸苔属和三叶草属植物等，可能需要借助解剖镜夹取花药，或是只把花被去掉，把花蕾的其余部分连同其中原封未动的雄蕊一起接种在培养基上。,在有些情况下，甚至是接种整个花序以得到花粉单倍体。然而这种简单化的方法只适用于这样一些基因型，即其中雄核发育在只含无机盐、维生素和糖的简单培养基上即可进行，而在这种培养基上孢子体组织增殖的机会很少。 不过，当必须使用生长素才能诱导花粉粒雄核发育的时候，应当尽可能把孢子体组织去掉。 由于
4、花药对离体培养的反应存在“密度效应”，因此每个容器中接种的花药数量不宜太少，以形成一个合理的群体密度。,5 .培养方式和培养条件,花药的培养方式主要有3种：一是在琼脂固化培养基表面培养，二是在加入3 0Ficoll的液体培养基表面飘浮培养，三是利用固体一液体双层培养基培养，以便既能保持较高的接种密度，培养基又不易失水干涸。,花药对培养温度的要求因物种而不同，对于大多数小麦品种来说，在培养的最初6d给以3032的较高温度，然后再转入2830下培养，花药出愈率会有明显提高。水稻花药培养的适宜温度从一开始就是27。愈伤组织分化阶段对温度的要求不像诱导阶段那样严格，例如小麦在 17和30下花粉愈伤组织
5、分化频率没有显著差异，水稻花粉植株的分化也多在和诱导期间相同的温度下进行。,对光照的要求在物种间差异更为明显，例如连续光照可显著增加烟草花粉胚的产量，却强烈抑制曼陀罗的花粉胚胎发生。禾谷类植物在花粉愈伤组织诱导期间则以暗培养或散射光培养效果较好，强光会抑制小麦花粉愈伤组织的形成。 愈伤组织的分化原则上都应在光照下进行，但对光照强度和照光时间的要求则因物种而异。例如水稻花粉愈伤组织在转入分化培养基之初仍不宜照光培养，须待35 d后再给以每天 14 h1000 2 000lx的光照，以免引起愈伤组织的老化坏死。对小麦花粉植株则不宜给以长日照。,6 花粉植株的诱导,烟草花药接种在无激素培养基上1周以
6、后，即有部分花粉粒开始膨大，2周以后细胞开始不断分裂，相继形成球形胚心形胚和鱼雷形胚等，3周后在花药开裂处即可见到许多淡黄色的胚状体，见光后变绿，并逐渐长成小苗。每个花药中长出的小苗数可从1株到几十株不等，最多者可达180株以上（图 72） 禾本科植物的花药在培养中通常不能形成胚状体，在这类植物中，花粉植株的诱导往往要分两步进行。首先，第一步，将花药接种在含有 2，4D（12 mgL）的诱导培养基上，诱导花粉粒形成单倍体愈伤组织。,然后，第二步，当花粉愈伤组织形成1015 d，其直径已长到 1520mm时，及时把它们转到分化培养基上诱导植株分化 。分化培养基中不含 2，4D，含有 NAA和 K
7、T各0.5mgL。在分化培养基上，愈伤组织表面陆续分化出芽和根（图72） 在烟草中，花粉植株是经由胚状体产生的，因此几乎都是单倍体。在稻麦等植物中，由于花粉植株是经由愈伤组织产生的，染色体数常有变化，其中既有单倍体，也有二倍体、三倍体以及各种非整倍体等。,7. 壮苗和移栽,以小麦为例，王培等采用的方法是：将已长出23片叶的花粉植株转人含有多效唑 3 mgL，NAA和 KT各 05 mgL的LH50mg /L和蔗糖 8的 MS培养基上，于2225下进行壮苗培养，然后在38低温弱光条件下越夏，深秋时炼苗移栽。,8.单倍体植株的二倍化,单倍体植株能正常地生长到开花期，但由于缺少同源染色体，减数分裂不
8、能正常进行，因而不能形成有活力的配子。为了得到可育的纯合二倍体，必须把单倍体植株的染色体组加倍。虽然在花粉植株中染色体可自发加倍，但其频率太低。 通过人工措施则可显著提高加倍频率。诱导染色体加倍的传统方法是用秋水仙素处理。在烟草中一般使用0.4的秋水仙素溶液。具体方法是：把幼小的花粉植株浸于过滤灭菌的秋水仙素溶液中 96 h，然后转移到培养基上使其进一步生长。秋水仙素处理也可通过羊毛脂进行，即把含有秋水仙素的羊毛脂涂于上部叶片的腋芽上，然后把主,茎的顶芽去掉，以刺激侧芽长成二倍体的可育枝条。为了加倍颠茄的单倍体细胞，Rashid和Street （ 19 7 4）在悬浮培养基中加入1g L秋水仙
9、素，处理2 4h之后，再把细胞转移到不含这种药物的培养基中，结果可使70的细胞二倍化。禾本科植物的染色体加倍，一般都是采用在分蘖盛期用秋水仙素溶液浸泡分蘖节的办法，例如小麦用 004秋水仙素处理 8 h，水稻，用 02的秋水仙素处理 24 h。为了增强处理效果，溶液内皆须加入l2的助渗剂二甲基（DMSO） 。 除了在分蘖盛期加倍之外，也可采用愈伤组织和试管苗染色体加倍方法，效果很好,9.离体花粉培养,花药培养器官培养，遗传上的异质性，药壁细胞有可能脱分化并增殖，所以不是纯粹的单倍体植株。 花粉培养可以进行单细胞培养，得到纯粹的克隆。最早的成功花粉培养是1970年的甘蓝的花粉悬滴培养法。,10.
10、在高等植物中单倍体的意义,由于多数突变是隐性，当同源染色体上有显性等位基因存在时，它们不能表现，因此在高等植物中突变常常不易发现。为了使隐性性状表现出来，需要对携有突变的植株反复自交。然而，某些物种，如茶和黑麦等，是自交不亲合的，不可能自交。此外，即使在有可能自交的情况下，4个个体中也只能有1个表现这个隐性性状。如果发生不止一个隐性突变，要想得到一个能表现所有突变性状的个体，机会还要少得多。与此相反，在单倍体中诱发突变很容易表现出来，这是因为单倍体只有一套基因，隐性突变的作用不会受到显性等位基因的干扰。携有有利突变的单倍体一经发现，就可以在一个世代之内，通过染色体加倍，而成为表现所有有利突变的可育二倍体。在具有高度杂合性的异花授粉作物中，用传统的方法固定特定性状需要78年的时间，若采用F1代植株花药（粉）培养，只要一个世代就可以达到这个目的。,10.,
