{医疗药品管理}高通量药物筛选

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1、高通量药物筛选High throughput screening HTS,高通量筛选最初是伴随组合化学而产生的一种药物筛选方式。 1990年末，组合化学的出现改变了人类获取新化合物的方式，人们可以通过较少的步骤、在短时间内同时合成大量化合物，在这样的背景下高通量筛选的技术应运而生。 高通量筛选技术可以在短时间内对大量候选化合物完成筛选，经过近十年的发展，已经成为比较成熟的技术，不仅仅应用于对组合化学库的化合物筛选，还更多地应用于对现有化合物库的筛选。 目前世界各大药物生产商都建立有自己的化合物库和高通量筛选机构，对有潜力形成药物的化合物进行篦梳式的筛选。,我国药物高通量筛选起步较晚，且不规范，

2、仅有十多年的研究历史。 1996年中国医学科学院引进国内第一台Bionek2000型实验自动化工作站； 1998年又引进全国第一台Topcount微量闪烁计数器，使放射配基实验、放射免疫实验等技术微量化、自动化。 上海药物研究所、北京军事医学科学院分别成立了药物筛选专门机构，开始从事大规模筛选工作。 西安交通大学药学院贺浪冲教授首创的细胞膜色谱（CMC）为化合物的体外高通量筛选提供了高选择性、高特异性、高效率的筛选手段。CMC已成功用于钙离子拮抗剂受体配体结合反应的研究，目前正在进行心血管化学合成药物的高通量筛选和中药有效部位及有效成分的寻找。今年将建立CMC自动化筛选体系，促进我国药物高通量

3、筛选技术的全面发展 。,一、 概念,高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体运转的技术体系。,HTS是药物快速、微量、灵敏、大规模筛选的新方法。采用分子、细胞水平的药物筛选模型，可从大量的样品中鉴别出对确定的分子靶点有相互作用的微量活性化合物。每年能处理成千万个样品，加速了先导化合物的发现进程。突破了传统药物筛选的模式，提高了新药研发的效率

4、。,高通量平行合成仪,液相芯片检测仪,微孔过滤板,12通道药物筛选仪,高通量平行合成仪,国家新药筛选中心,二高通量筛选的技术过程,1、样品库 2、初筛和复筛 3、活性化合物 4、深入筛选 5、获得少量先导化合物 6、确证筛选药物药理学研究 7、侯选药物 8、临床前研究,1、HTS筛选的基本步骤,第一步是选择分子靶。选择的依据是来源于国际医学生物学的新成果。目前国际常用的分子靶有以下几类：A、细胞膜受体；B、离子通道蛋白；C、酶蛋白；D、细胞核受体；E、转运蛋白。 第二步是建立稳定表达分子靶的生物体系。 靶是蛋白-克隆相对应的蛋白，在大肠杆菌中表达和提纯； 靶是细胞受体-克隆出的基因转化到载体细

5、胞中，建立稳定的细 胞株。,第三步建立简便快速的大规模的生物检测方法。 根据靶的不同分为两类： 1、以蛋白等分子为基础； 2、以 细胞为基础 酶蛋白-测定酶活性的变化； 细胞膜受体-测定配体-受体的结合； 细胞核受体-测定蛋白的表达。 在建立大规模生物检测方法的同时，要用组合化合物的方法合成大量不同结构的化合物库相配套。,2、HTS药物筛选靶点与检测方法,（1）、分子靶点筛选模型-细胞信号通路筛选系统 外界信号从细胞表面传递到细胞内，或者直接穿过细胞膜进入到细胞质和细胞核，最终影响某些基因的转录。在这个传递过程中，某些特殊的细胞或一些病理状况下，可能是其中的一条或几条通路起作用，药物可以根据需

6、要对这些通路进行阻断。 使用信号通路筛选系统，可直接对药物作用的分子机制有所了解。,（2）、细胞膜表面受体筛选模型 a.G蛋白耦联受体：受体与GTP结合的调节蛋白的耦联，在细胞内产生cAMP，从而将外界信号跨膜传递到细胞内。如趋化因子受体、-受体阻断剂等。 b.催化受体：为单跨膜受体，分为胞外区，跨膜区和胞内区。当细胞因子与胞外区结合后，引起多个受体单体的聚合，每个聚合体的受体单体可以是同一类型，也可以不同。如EPO、G-CSF、GH受体2个同样的单体；IL-1，GM-CSF，IL-6受体是2个不同的单体；TNF-是3个同样的单体；IL-2是3个不同的受体。 c.离子通道耦联受体 ：细胞表面一

7、些神经递质的受体，自身是一些离子通道，或者与离子通道相耦联。当与配体结合时，受体构象改变，通道开放，离子进出细胞，引起电兴奋。,三. 高通量筛选技术体系的组成,1. 化合物样品库 化合物样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。 其中,人工合成又有常规化学合成和组合化学合成两种方法。,2.自动化的操作系统 自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件采用实物图像代表实验用具，简洁明了的图示代表机器的动作。 自动化操作系统的工作能力取决于系统的组分，根据需要可配置加样、冲洗、温解、离心等设备以进行相应的工作。,3.高灵敏度的检测系统 检测系统一般采用 液闪计数器、 化学

8、发光检测计数器、 宽谱带分光光度仪、 荧光光度仪等。,4.数据库管理系统 数据库管理系统承担4个方面的功能: 样品库的管理功能; 生物活性信息的管理功能; 对高通量药物筛选的服务功能; 药物设计与药物发现功能。 5、 高特异体外筛选模型,四. 高通量筛选模型,常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平， 观察的是药物与分子靶点的相互作用， 能够直接认识药物的基本作用机制。,1.分子水平的药物筛选模型: (1).受体筛选模型:指受体与放射性配体结合模型。以受体为作用靶的筛选方法,包括检测功能反应、第二信使生成和标记配体与受体相互作用等不同类型。 (2)酶筛选模型:观察药物对酶活性的影响。根据酶的特点,

9、 底物,产物都可以作为检测指标,并由此确定反应速度。典型的酶筛选包括（1) 适当缓冲液中孵化;(2)控制反应速度,如:温度,缓冲液的pH值和酶的浓度等;(3) 测量产物的增加和底物的减少。 (3)离子通道筛选模型: (1)贝类动物毒素的高通量筛选,其作用靶为Na+通道上的蛤蚌毒素结合位点，用放射性配体进行竞争性结合试验考察受试样品。(2)用酵母双杂交的方法高通量筛选干扰N型钙通道3亚单位与1亚单位相互作用的小分子，寻找新型钙通道拮抗剂。,2.细胞水平药物筛选模型 观察被筛样品对细胞的作用。但不能反映药物作用的具体途径和靶标,仅反映药物对细胞生长等过程的综合作用。包括: 内皮细胞激活; 细胞凋亡

10、; 抗肿瘤活性; 转录调控检测; 信号转导通路; 细菌蛋白分泌; 细菌生长。,高通量筛选技术与传统的药物筛选方法相比有以下几个优点: 反应体积小；自动化；灵敏快速检测；高度特异性。但是，高通量筛选作为药物筛选的方法,并不是一种万能的手段，特别是在中药研究方面，其局限性也是十分明显的。,五、高通量药物筛选原理,1基本原理 高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系，它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理。它的正常开展需要有一个高容量的化合物库、自动

11、化的操作系统、高灵敏度的检测系统、高效率的数据处理系统以及高特异性的药物筛选模型。,（1） 化合物样品库 高通量筛选是一种利用已有的化合物进行的体外随机筛选。 因此通过高通量药物筛选发现先导化合物(leading compounds)的有效性取决于化合物样品库中化合物的数量及其质量。 化合物样品的数量是指不同样品的数量。 化合物样品的质量由化合物结构的多样性决定的。 许多活性反应基团(reactive groups)使初筛的假阳性大量增加，剔除这些化合物可以提高化合物样品库的质量。,化合物样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。 人工合成又可分为常规化学合成和组合化学合成两种方法。采

12、用常规化学合成的纯化合物一直是国外制药企业建立化合物样品库的主要来源。它们通过长年积累的化合物建立化合物样品库，通过购买和化合物交流使化合物样品库的数量和质量大幅度提高。,组合化学(combinatorial chemistry)的出现为大量增加化合物的数量提供另外一种来源。组合化学的基本原理是采用适当的化学方法，在特定的分子母核上加入不同的基团，在同样条件下，产生大量的新化合物。这种方法在化合物的结构改造和优化方面已经表现出强大的优势。但是，由于该方法是基于母核结构的改造，因此产生的大量化合物在结构多样性方面尚有不足。解决组合化学产物结构多样性的问题，已经成为化学研究人员的研究课题。,从天然

13、产物中分离出来的化合物，母核结构和活性基团是长期的自然选择形成的，它们通过高通量筛选所表现出来的生物活性在药物发现中具有人工合成化合物所不能比拟的优势。因此，增加具结构多样性的天然化合物及其衍生物是提高样品库质量的一个重要途径。跨国制药企业为了增加高通量筛选的阳性率，已经或正在寻求购买我国的天然产物单体。,(2) 自动操作系统 高通量药物筛选每天要对数千化合物样品进行检测，工作枯燥、步骤单一，人工操作容易疲劳、出错。 自动化操作系统采用微孔板作为反应容器，具有固定的分布模式(format)；不同的微孔板通过条形码加以标记。自动化操作系统通过光电阅读器对特定的微孔板上的特定位置进行操作，并将操作

14、结果及相关数据存贮在计算机内，使筛选结果准确，实验过程快速。,除了实验步骤的需要以外，自动化的加样方式是决定筛选速度的重要因素。目前主要有单孔、8孔、96孔、384孔等几种方式。单孔一般用于对照样品以及复筛中零散样品的转移。96孔、384孔在酶活性检测以及需同时开始、同时终止反应的筛选模型中是必需的。 自动化操作系统的一个重要组成部分是堆栈(hotel)。所谓堆栈是指在操作过程中用来放置样品板、反应板以及对它们进行转移所需的腾挪空间。因此，高通量筛选的样品数量取决于堆栈的容量。,由此可见，高通量药物筛选的自动化操作系统由计算机及其操作软件、自动化加样设备、温孵离心等设备、堆栈4个部分组成。不同

15、的单位可根据筛选模型类型、筛选规模选购不同的部分整合成为一个完整的操作系统。,(3 )检测系统 快速、高灵敏度的检测技术是高通量药物筛选的关键技术之一。在高通量药物筛选中，检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。检测仪器灵敏度的不断提高，即使对微量样品的检测，也可以得到很好的检测效果。,A. 放射性检测技术。 美国学者GanieSM在高通量药物筛选研究中，应用放射性测定法，特别是亲和闪烁（SPA）检测方法，使在96孔板上进行的样本量实验得到发展。该方法灵敏度高，特异性强，促进了高通量药物筛选的实现，但存在环境污染问题。,液闪计数 放射性同位素广泛用于受体结合测定、细胞毒性、细胞增殖实验、药物代谢示踪以及基因分析中。由于采用了双光电倍增管及时间分辨偶合回路(time-resolved coincidence circuit)技术，有效地降低了背景信号的干扰，使测定灵敏度提高，同位素用量少。在96孔板的分析检测中，背景信号可控制在10cpm左右。,亲和闪烁分析(scintil1ation proximity assay，SPA)是一种新的液闪分析法。在高通量筛选测定细胞表面受体亲合结合作用时，放射配体标记滤过分析技术由于需要进行分离，现已被亲合闪烁分析所取代。 亲合闪烁分析技术通过亲合结合，将放射性配基结合到具有受体的闪烁球上，从而产生