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1、药物分析,主讲: 罗容珍,Pharmaceutical Analysis,第十一章 抗生素类药物的分析,2020/8/2,Contents,2020/8/2,第一节 概述,1.抗生素（antibiotics） 在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称,2020/8/2,第一节 概述,3.来源,生物合成（发酵） 化学合成或半合成,4.特点,化学纯度较低 活性组分易发生变异 稳定性差,2020/8/2,第一节 概述,5.抗生素质量分析生物学法、物理化学法,鉴别：理化方法、微生物法 检查：水分、pH值、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等 含量/效价测定：
2、微生物法 ： 与临床疗效吻合,灵敏度高，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大 理化方法：准确度与专属性较高, 且操作简便；但与临床疗效有偏差,2020/8/2,第二节 内酰胺类,青霉素(苄青霉素) (penicillins),氨苄西林,阿莫西林,2020/8/2,第二节 内酰胺类,头孢氨苄,头孢拉定,头孢羟氨苄,头孢噻吩钠,2020/8/2,第二节 内酰胺类,氢化噻唑环,氢化噻嗪环,2020/8/2,第二节 内酰胺类,一、结构与性质,1.酸性（羧基） pKa 2.5-2.8，酸性较强。碱金属盐水溶性好，有机碱盐难溶于水。,普鲁卡因青霉素,2020/8/2,第二节 内酰胺类,2.手性C
3、（旋光性）,3.UV,青霉素类：苯环取代基 头孢菌素类：母核有共轭结构,260nm,2020/8/2,4. 内酰胺环(四元环张力+酰胺键 ),第二节 内酰胺类,干燥条件较稳定，溶液不稳定,某些氧化剂、金属离子、温度,2020/8/2,第二节 内酰胺类,二、Identification,2020/8/2,第二节 内酰胺类,2020/8/2,第二节 内酰胺类,2020/8/2,第二节 内酰胺类,头孢利定的NMR鉴别法(JP14),取本品50mg溶于0.5ml重水中，测定NMR光谱时，应显示 3.8 附近 6.97.5 7.99.0 单峰信号 多重峰信号 多重峰信号 2 ： 3 ： 5,2020/8
4、/2,第二节 内酰胺类,(三)呈色反应,1）羟肟酸铁反应内酰胺环,（红、棕、褐）,2）茚三酮反应-氨基,2020/8/2,第二节 内酰胺类,3）双缩脲反应内酰胺类,2020/8/2,第二节 内酰胺类,4）变色酸-硫酸反应,5）重氮苯磺酸反应酚羟基,（偶合）,6）铜盐反应头孢氨苄的专属反应,2020/8/2,7）硫酸-甲醛反应(BP),第二节 内酰胺类,青霉素钾和青霉素钠呈红棕色,(四)焰色反应K+、Na+,三、Purity Test(聚合物、有关物质、异构体等),1.聚合物,头孢他啶中聚合物测定,2020/8/2,第二节 内酰胺类,色谱条件与系统适用性试验 用葡聚糖凝胶G-10（40120m）
5、为填充剂，玻璃柱内径1.31.6cm，床体积5060ml；流动相A为含3.5%硫酸铵的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钠2.19g和磷酸二氢钠0.54g，加水100ml使溶解，调节pH至7.0），流动相B为水；流速为0.8ml/min；检测波长为254nm。以流动相A为流动相，用0.1mg/ml蓝色葡聚糖2000溶液进样200l进行测定，理论板数应不低于900，拖尾因子在0.751.5。两种流动相系统中蓝色葡聚糖的保留时间比应在0.931.07之间。对照品溶液以流动相B为流动相，重复进样200l，峰面积值的相对标准差应小于5.0%。,对照品溶液的制备 取头孢他啶对照品适量，精密称定，加
6、水制成每1ml中含头孢他啶100g的溶液，摇匀,2020/8/2,第二节 内酰胺类,测定法 取本品适量，精密称定，加水制成每1ml中约含头孢他啶20mg的溶液，立即进样200l，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图；另取对照品溶液200l注入液相色谱仪，以流动相B为流动相，记录色谱图，按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3%,主成分自身对照法 面积归一化法 限量法 自身对照外标法,2020/8/2,萄聚糖凝胶 立体网状结构图,原理“分子筛”,第二节 内酰胺类,2020/8/2,第二节 内酰胺类,2.有关物质与异构体,头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查,色谱条件与系统适用性
7、试验：ODS分析柱；0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）为流动相，流速1ml/min；检测波长278 nm。要求头孢呋辛酯A，B异构体之间，头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯2-异构体之间的分离度应大于1.5；理论板数按头孢呋辛酯A异构体峰计算，应不低于1500,异构体 取本品适量，配制成每1ml中约含0.25mg的溶液，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图。B异构体峰的相对保留时间约为0.85，A异构体峰的相对保留时间为1.0。,2020/8/2,第二节 内酰胺类,供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.480.55。,B,A,3-,E,E,2020/8/2,第
8、二节 内酰胺类,有关物质,取本品适量，精密称定，加流动相制成约含0.25mg/ml的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相制成2.5 g/ml的溶液，作为对照溶液。取对照溶液20l注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%，再取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的3.5倍，供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，其中E异构体峰面积不得大于对照溶液主峰面积之和(1.0%)，3-异构体峰面积不得大于1.5倍(1.5%)，其余单个杂质峰面积的和不得大于3倍(3.0%)。(供试品溶液中任何小于对照品溶液主峰面积之和0.05倍
9、的峰可忽略不计),2020/8/2,3.UV,第二节 内酰胺类,4.有机溶剂,5.结晶性,第一法(偏光显微镜法) 第二法(X射线粉末衍射法),四、Assay,碘量法 汞量法 酸碱滴定法 羟肟酸比色法 HPLC法,2020/8/2,第二节 内酰胺类,阿莫西林克拉维酸钾片,色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，加水900 ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至4.40.1，加水稀释至1000ml)-甲醇(95:5)为流动相；流速为0.7ml/min；检测波长为220nm。阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5,测定法
10、取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉维酸0.25mg的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。,2020/8/2,第二节 内酰胺类,2020/8/2,第三节 氨基糖苷类,氨基环醇+氨基糖苷,链霉素 (Streptomycin),2020/8/2,第三节 氨基糖苷类,巴龙霉素 (paromomycin
11、),D-葡萄糖胺脱氧链霉胺,巴龙胺,D核糖巴龙霉糖,巴龙二糖胺,2020/8/2,第三节 氨基糖苷类,庆大霉素 (gentamycin),绛红糖胺,(紫素胺),2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,(N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺),2020/8/2,第三节 氨基糖苷类,一、结构与性质,1）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐 2）溶解度（氨基、羟基）：水溶性 3）旋光性（糖）：多个手性碳 4）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解,2020/8/2,二、Identification,第三节 氨基糖苷类,坂口反应,麦芽酚反应,N-甲基葡萄 糖胺反应,2020/8/2,第三节 氨基糖苷类,1.茚三酮反应羟基胺类,
12、-氨基酸,2. Molisch 试验 五碳糖或六碳糖结构,2020/8/2,第三节 氨基糖苷类,蓝紫色,3. N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）,红色,2020/8/2,第三节 氨基糖苷类,乙酰丙酮,OH-,2020/8/2,第三节 氨基糖苷类,4.麦芽酚反应链霉糖特有反应,H+,5.坂口反应链霉胍特有反应,6.硫酸盐反应,2020/8/2,7.色谱法 8.光谱法,第三节 氨基糖苷类,三、Purity Test,1.链霉素中链霉素B（甘露糖链霉素）的检查,来源：发酵中产生,方法：TLC中的对照品法,2.硫酸奈替米星中西索米星的检查(TLC),3.庆大霉素C组分的测定,2020
13、/8/2,第三节 氨基糖苷类,色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水冰醋酸甲醇(25:5:70) 配制的0.02mol/L庚烷磺酸钠溶液为流动相（必要时调节甲醇的含量）；检测波长为330nm 。理论板数按C2组分峰计算应不低于2000。C2a 峰和C2峰的分离 度应符合要求。 测定法 取本品适量，精密称定，加水制成每1ml 中含0.65mg的溶液，精密量取4.0 ml，置10ml量瓶中，加异丙醇2ml与邻苯二醛试液1.6ml，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，置60水浴中加热15分钟，冷却，滤过，取续滤液10l 注入液相色谱仪，记录色谱图； 另取庆大霉素标准品，同法测定。C组分
14、的保留时间依次为：C1、C1a、C2a、C2。量取C1、C1a、C2a、C2的峰面积。 C1应为2550，C1a应为1540，C2aC2应为2050 。,2020/8/2,第三节 氨基糖苷类,庆大霉素无紫外吸收，需进行衍生化处理后再进行HPLC测定。,max = 330nm,2020/8/2,讨论,第三节 氨基糖苷类,1、柱效：以C2峰计算，理论板数应不低于2000，在此柱效下各组分之间才能达到规定的分离度。为此色谱柱做适当选择。 2、流动相：流动相极性适当控制(适当调节甲醇的比例)。 极性过强，出峰快，分离不佳。C1峰与衍生试剂等杂质峰难分析;极性过弱，出峰太慢。实验表明，C2峰的保留时间控
15、制在20min30min较为适宜。 3、衍生化试剂与衍生物的稳定性：配制后不能久置，时间久了试剂峰峰高增加并影响组分测定，一般避光保存可使用三天。生成的衍生物不稳定。 4、离子对试剂浓度影响：离子对试剂浓度对庆大霉素OPA衍生物保留值有影响。,2020/8/2,第三节 氨基糖苷类,BP(2005)HPLC-ECD Ch.PHPLC-ELSD,4.硫酸盐测定EDTA滴定,四、Assay,微生物检定法 HPLC法,2020/8/2,第四节 四环素类,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,2020/8/2,一、结构与性质,第四节 四环素类,1）两性： -OH酸性 N(
16、CH3)2碱性,Ca2+、Mg2+生成不溶性盐；Fe3+形成红色配合物； Al3+形成黄色配合物 ；pH3 7.5 多价阳离子与酚二酮荧光,与酸、碱均可成盐； 临床多用盐酸盐； 强酸或强碱中溶解度,2）旋光性 3）UV和荧光 4）与金属离子络合(酚羟基、烯醇基),2020/8/2,弱酸性（pH2-6） A环C-4异构化 差向四环素 酸性（pH 2） C环脱水 脱水四环素 碱性 C环开环，形成内酯 异四环素,5）不稳定性,第四节 四环素类,A.差向异构化,蓝色荧光,淡黄黑,2020/8/2,第四节 四环素类,（氢键，土霉素、多西环素不易差向异构化）,2020/8/2,第四节 四环素类,B.酸性脱水降解,max = 445nm,max = 435nm,2020/8/2,C.碱性脱水降解,第四节 四环素类,OH-,2020/8/2,第四节 四环素类,二、
