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1、中药药效研究 技术规范若干问题的探讨,北京中医药大学 中药药理系 孙建宁 教授,中药新药的基本要求是安全、有效、可控和稳定。 侯选样品 - 药效学 -侯选药物 毒性研究,一、药效学研究的基本目的,（一）通过药效学研究确定有效性 是否有效、作用的强弱、优缺点和特色，确定有无开发前景。 重视前期药效的筛选，力求得到较准确的药效评价。设法找出主要药效学的特点、有效作用剂量范围（量效关系）、有效作用时间长短（时效关系) 。,（二）提高临床疗效 应充分运用现代科学特别是现代医学的理论、方法和手段，制定科学、严密、具有中医药特点的试验计划 ，建立与临床相符的 “病” “症”或“证”相似的动物模型与指标，对
2、新药的有效性作出科学的评价。,三、药效学研究的方法及注意事项,药效研究参考资料: 1、中药新药研究指南（药学，药理学，毒理学）中华人民共和国卫生部药政管理局，1994：66-67 2、中药新药研制开发技术与方法 王北婴、李仪奎主编 上海科学技术出版社2001.12 3、中药药效研究思路与方法陈奇主编 人民卫生出版社 2004.12 4、中药药理研究方法学 陈奇主编 人民卫生出版社 2006.1 5、中药药理实验方法学 李仪奎主编 上海科学技术出版社 2006.10 6、国内外研究论文,1、实验设计,符合中药特点；符合国家新药研究申报的有关规定；随机、对照、重复 筛选(处方、工艺、有效部位） 重
3、视中药复方配伍规律性的研究,(1)单味研究法 (6)正交设计法 (2)药对研究法 (7)正交t值法 (3)药物组间关系法 (8)均匀设计法 (4)撤药分析法 (9)量效关系法 (5)聚类分析法,撤药分析法: 从复方中撤出一味或一组药进行实验,均匀设计法： 按均匀设计表安排，实验次数与各因素所取水平数相等。 如：治疗感染复方（五种中药X1、X2、X3、X4、X5）。根据因素与水平，选用U11表设计，结果算得回归方程，有显著性意义，从标准相关系数可看出药物（抗炎）作用大小，进行优选。,量效关系法： 四君子汤：党参、白术、茯苓、甘草 1 ： 1 ： 1 ：0.5 巨噬细胞吞噬功能增强，调整甘草到1/
4、3，功能减弱。 当归补血汤: 黄芪、当归 5 ： 1 免疫增强作用，调整黄芪剂量（1/2、2、4倍）均作用不明显。,有效部位的确认 样品：粗制剂 有效部位 剩余部分 剂量：二个剂量 评价指标：与主要药效指标一致,2、动物选择,种类：实验常用小鼠和大鼠 、豚鼠 、家兔 、狗 品系： 动物等级：二级动物即清洁动物（CL） 性别：一般试验选用雌雄各半动物。 数量：一般小鼠不得少于10只；大鼠为8只；猫、狗为4只以上。,3、药效学研究内容的设计,根据主治，参考功能，选择试验方法针对性强、重点突出、主次分明。,缺血性中风治疗的药效学研究,1增加缺血区脑血流量 2神经细胞的保护治疗,中药治疗缺血性中风主要
5、药效学研究方案,选用大鼠大脑中动脉血栓模型(middle cerebral artery thrombosis,MCAT)和双侧颈总动脉阻断致不完全性脑缺，观察连续给药2-3天对局部脑缺血和不完全性全脑缺血性损伤的保护作用。,1、防治缺血性中风药物研究常用动物模型,（1）局灶性脑缺血动物模型 微栓子栓塞阻断法 开颅机械闭塞法 血管内栓线阻断法 化学刺激诱导血栓性闭塞法 光化学诱导血栓形成法 内皮素-1(ET-1)灌注诱导血管收缩法,（2）全脑缺血模型 大鼠两动脉阻断缺血模型 大鼠三动脉阻断缺血模型 大鼠四动脉阻断缺血模型 小鼠断头缺血模型,人 大 脑 血 管 系 统,线栓模型制备,模,型,制,
6、作,FeCl3贴敷致MCAT模型,2、评价指标,（1）脑梗死范围 （2）神经症状 （3）脑血流量（CBF）或区域性脑血流量（ICBF） （4）脑组织含水量 （5）脑内神经递质,（6）脑组织生化指标：包括能量代谢和毒性产物，如三磷酸腺苷（ATPase）、磷酸肌酸（Per）、乳酸（LA）、乳酸脱氢酶（LDH）、自由脂肪酸（FFA）、脂质过氧化物（LPO）、兴奋性氨基酸（EAA）及基因表达等。 （7） 神经细胞病变程度：应进行定性、定量组织学观测。,3、结合功效选做内容,益气活血 微循环试验 血小板聚集性试验 血栓形成试验 凝血时间、凝血因子的测定 血液流变学试验 清热解毒 脑组织炎性因子,Infa
7、rct size of rats with tMCAO(TTC staining),Sham,Vehicle,Sham,Vehicle,Normal,0,1,3,4,2,神 经,评 分,治疗抑郁症药效学研究,抑郁症发病的机制,单胺递质与抑郁症 脑内去甲肾上腺素（NE）与抑郁症关系密切； 5-羟色胺（5-TH）与抑郁症关系密切。 两种甚或3种单胺神经递质系统功能失去平衡便会导致抑郁症。,下丘脑垂体肾上腺（HPA）轴负反馈失调与抑郁症 促肾上腺皮质激素释放激素(CRH) 应激刺激，如低血糖、失血、剧痛以及精神紧张等,引起HPA轴兴奋性提高，然后通过CRH引起垂体肾上腺皮质系统反应。CRH不仅能作用
8、于内分泌系统，而且参与应激反应。过多的应激刺激会造成CRH的过度分泌和HPA轴亢进，到成年后其抑郁症发病机率会更高，从而出现一系列抑郁症状，如睡眠和饮食障碍，性欲下降和精神行为改变等。,促肾上腺皮质激素(ACTH) 在HPA轴中，ACTH的测量被证明在判定情感障碍性疾病中十分有用。因为HPA的功能阻断包括了脑垂体和中枢神经系统，有证据可以证明ACTH是可以影响动物甚至人的行为的，脑垂体ACTH的释放和肾上腺皮质醇并不只是单独的存在释放与反馈的作用机制。研究表明，在生理紊乱情况下，其他对肾上腺皮质醇的刺激会同ACTH共同发挥作用。,肾上腺皮质激素 抑郁症患者的肾上腺皮质增生约38，增生的程度与皮
9、质醇有关；随着抑郁症状的缓解，这种增生也似乎随着皮质醇的正常化而逐步消失，这与HPA轴的慢性或持续活跃有关。许多研究者都证实，有HPA轴活动亢进的患者和一些抑郁患者中，这种脉冲式的皮质醇分泌节律更频繁也更持久，因此推测这种分泌方式可能参与了抑郁的发病。,糖皮质激素受体 抑郁病人的HPA系统常常可以出现一些明显的改变，并且可以被抗抑郁药所纠正。HPA轴活化的一个主要特征就是肾上腺皮质激素受体(GR)对ACTH产物即皮质醇的敏感性下降，其功能也降低。皮质激素的作用效果主要依靠细胞受体的调控，特别是GR。许多研究都表明抑郁患者的GR数量和功能下调。,HPA轴与免疫机制 有研究表明，重症抑郁是以HPA
10、轴活动亢进和伴有IL-1、IL-2产物增加的免疫系统激活为特征的。已经知道IL-1、IL-2能够增强HPA轴在免疫反应中的活性。,HPA轴与5HT 在抑郁的发病机制中，已经证实HPA轴和5-HT之间有着紧密的联系。皮质类固醇是通过糖皮质激素受体和盐皮质激素受体来调节5-HT的功能，主要是二者的比例发生改变，同时5-HT受体mRNA水平及传导功能降低，支持经典的抑郁发病过程中5-HT功能低下的学说。 5-HT受体有许多亚型，每个亚型又可以分为次亚型，相互之间功能不同。,脑细胞再生凋亡与抑郁症 近代神经科学发现脑细胞同样存在着凋亡与再生现象，二者的平衡是维持正常脑功能的重要因素。抑郁症患者脑内存在
11、特定部位的脑萎缩现象，促使许多学者将研究注意力转向应激脑损伤和抗抑郁剂神经保护作用的研究上来.,抑郁症的细胞分子机制,在信号转导水平上，抗抑郁剂长期用药后引起G蛋白偶联受体的腺苷酸环化酶(AC)-cAMP-PKA信号通路活性增强，却降低PLC-PKC信号通路的活性，据此，有的学者提出AC-PKA与PLC-PKC信号转导平衡失调是抑郁症发病的机制。,在基因转录水平上，cAMP作为第二信使，它激活相应的功能蛋白CREB(cAMP反应元件蛋白)，继而作用在靶基因上，激活基因的表达。抗抑郁剂慢性用药后，海马中cAMP和CREB的mRNA含量增加，而且，脑源性神经生长因子(BDNF)及其受体trKB的m
12、RNA也增加。脑内注入BDNF可显示抗抑郁作用。,抗抑郁药物研究中常用的动物模型,药物诱发的抑郁模型： 包括育亨宾增强、利血平拮抗、5HTP诱发抑郁行为等。 改变环境条件诱发的抑郁模型： 如束缚、嗅球切除、隔离诱发过度活动、疲劳应激、行为绝望、慢性不可预知应激、慢性温和应激等。 遗传行为抑郁模型： 如游泳低活性（SwLo）模型、FSL （Flinders sensitive line）大鼠模型，后者因具有与人类抑郁个体相似的行为特征和对环境刺激、抗抑郁药物的反应性，因此被认为具有很强的实用性。 针对相关靶点分子的基因缺陷动物模型： 如interleukin-6 (IL-6) knock-out
13、mice, CREB-deficient mice等。,有效性评价,三个主要原则：,现实有效性,建造有效性,预测有效性,即动物模型与抑郁症的临床特征具有相似性,即构建动物模型理论的合理性,即对抗抑郁药物的反应性,常用抑郁症模型,慢性轻度不可预见性应激抑郁模型： 行为绝望抑郁模型：大、小鼠游泳试验、悬尾实验等。 获得性无助抑郁模型： 脑损伤模型：常采用切除双侧嗅球可使大鼠产生抑郁症状，并伴有活动过多的表现。 药物相互作用模型：利血平拮抗、5-HTP诱导的甩头行为、高剂量阿朴吗啡拮抗等。 遗传选择性抑郁模型：如对胆碱能剂高度敏感，适应能力极差的Fliders Sensitive Line(FSL)
14、大鼠、Wistar Kyoto大鼠等可作为遗传选择性抑郁动物模型。,动物模型的建立及评价,用于药物筛选的模型： 要求：经济简便、试验时间短、预测有效性高 行为绝望：强迫游泳（The forced swimming test），悬尾试验(The Tail suspension test)。 药物诱发：5HTP和利血平。 用于行为药理及作用机制研究的模型： 要求：临床抑郁症的关联性强，有效性高 慢性应激模型 嗅球切除模型,行为绝望型模型：,14cm,20cm,10cm,25,6min,强迫游泳,悬尾试验,原理：动物置入不可逃避环境游动、挣扎、试图逃脱不动放弃逃避的希望行为绝望状态模拟抑郁症状。 应
15、用注意： （1）对多数的抗抑郁药物有效。但氟西汀受种属影响，对ICR无效。 （2）精神运动兴奋药物有阳性结果，需要运用开场装置或小鼠自主活动仪等观察小鼠的自主活动，以排除药物对此可能产生的影响。 （3）FST和TST均应当注意测试过程和程序参数对动物行为的影响，包括水温、水深、筒的直径、鼠尾固定的松紧程度、倒悬小鼠与周边的距离等，以增加预测药物效果的可靠性。,举例：药物对绝望行为的改善小鼠强迫游泳,举例：药物对绝望行为的改善小鼠悬尾,造膜方法： 利血平模型：利血平2.5mg/kg，ip。 5HTP诱导甩头模型： 帕吉林100mg/kg，ip，2.5h后给与阳性药和受试药，45min后5HTP
16、10mg/kg，ip，15min后观察小鼠的甩头次数。,利血平、5HTP小鼠模型,原理： 利血平能耗竭脑组织中的单胺类神经递质，其作用可以被具有增强单胺能传递的抗抑郁药物所拮抗 ； 帕吉林是一种单胺氧化酶抑制剂，能升高突触间单胺递质。5HTP为5HT的前体，可以特异性的增加脑组织中5HT，导致动物出现甩头行为，而增加5HT释放的抗抑郁药物可以增强这种行为； 用于评价药物对单胺递质的影响 。,举例：对利血平模型行为的影响,p0.05与利血平组相比，p0.01与利血平组相比,p0.05与帕吉林和5HTP组相比， p0.01与帕吉林和5HTP组相比,四逆散能明显增高利血平模型小鼠的体温（p0.01），减少眼睑下垂动物个数。,举例：对5HTP模型行为的影响,SNEC能明显增加5HT
