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1、,基 因 工 程,生物工程专业核心课程,授课教师:李京京,Genetic Engineering,1.基因工程概述 2.基因工程的基础知识与基本技术 3.基因工程所需基本条件 4.基因工程的操作过程 5.目的基因的获取 6.克隆基因的表达 7.转基因生物技术,一、基因工程概述,1 基因工程的基本概念 2 基因工程的诞生 3 基因工程的研究内容 4 基因工程的应用 5 基因工程的安全性,A 重组DNA技术的基本定义,重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子
2、克隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。,1 基因工程的基本概念,B 基因工程的基本定义,基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。,2 基因工程的诞生,A 基因工程诞生的理论基础,1 ) DNA是遗传物质,肺炎双球菌转化实验, 1944年 Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。,噬菌体转染实验, 1952年Alfred Hershy和Marsha Chase进一步证明遗
3、传物质是DNA。,2) DNA双螺旋结构,1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。,3 ) 中心法则和遗传密码,1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”,DNA,RNA,protein,1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等终于破译了64个遗传密码,B 基因工程诞生的技术突破,1 ) 限制性内切酶（restriction enzymes）,1970年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。,Werner Arber 理论预见限制酶,Hamilt
4、on O. Smith 得到第一个限制酶,Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断,2 ) DNA连接酶（ligase）,1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。,3 ) 载体（vector）,1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。,4 ) 感受态体系,1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S. Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。,5 ）逆转录酶,1970年Baltimore等人和Temin等人同时各自发现了逆转录酶。,6 ）琼脂糖凝胶电泳,1
5、960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。,7 ）DNA测序技术,1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert发明了DNA快速测序技术。,C 基因工程的诞生,1 ）Berg的开创性实验,1972年斯坦福大学的Paul Berg小组完成了首次体外重组实验：,将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连接起来。,2 ）Boyer-Cohen实验,1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。,后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101
6、质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。,Boyer-Cohen实验,3 基因工程的研究内容,1 ）目的基因的获取,从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。,2 ）重组体的制备,将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗生素抗性）的载体分子上。,3 ）重组体的转化,将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。,4 ）克隆鉴定,挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。,5 ）目的基因表达,使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。,基因工程基本过程,大鼠生长激素基因转入小鼠,4 基
7、因工程的应用,A 基因工程在医药上的应用,1 ） 基因制药,通过DNA重组技术将天然存在于人体内起着各种生理功能且含量甚少以至微量的活性多肽、蛋白质、糖肽所编码的基因片断导入微生物或哺乳动物细胞中进行扩增和表达,通过纯化、提取制备出高纯度、高活性的生物有效物质.,1976年，27岁的风险投资人Robert Swanson与 University of California的教授Herb Boyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech （Genetic Engineering Technology）。,Genentech,19
8、82年,首次批准重组动物疫苗-抗球虫病疫苗. 1982年,第一个基因工程药物-人胰岛素生产上市.,三大类基因药物产品:,生物活性多肽,单克隆抗体,疫苗,2 ) 基因治疗,将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。,（仍在探索阶段）,B 基因工程在农业生产中的应用,1 ) 提高植物的光合作用效率,（1）提高CO2的固定率,改变与光合作用有关的酶的结构和组成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。,（2）提高光能吸收率和转化率,改变光能交换系统的分子的基因结构。,2 ) 提高豆科植物的固氮效率,使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。,3 ) 转基因植物,是农业生
9、物技术的主要内容。 是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。,4 ) 转基因动物,将外源基因导入动物细胞，并在基因组内稳定整合，遗传给后代。改善子代特性;研究遗传性疾病的动物模型; 使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等。,C 基因工程在工业中的应用,1 ) 纤维素的开发利用,克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。,2 ) 酿酒工业,用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。,D 基因工程在环境保护中的应用,1 ) 检测水污染,用重组细菌或转基因鱼等检测水污染,2
10、 ) 生物降解,用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。,5 基因工程的安全性,A 基因工程的安全隐患,1 ) 对环境的影响,重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。,2 ) 新型病毒的出现,制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。,3 ) 癌症扩散,将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。,4 ) 人造生物扩散,新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。,B 重组DNA研究的安全准则,1 ) 公众的担忧,1973年美国的公众第一次公开表示担心应
11、用重组DNA技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。,2 ) 专家的态度,1974年美国国立卫生研究院（NIH）考虑到重组DNA的潜在危险，提请Paul Berg博士组成一个重组DNA咨询委员会。,这个由11名分子生物学和重组DNA权威学者组成的委员会在同年7月发表公开信（science,158,303)，要求在没有弄清楚重组DNA所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒）。,3) 制定安全规则,1976年6月23日，NIH正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。,规定了安全防护（物理防护和生物防护）标准以及禁止若干类型的实验。 1979年、1981年、1989年NIH又做了多次修改，放宽了许多限制。,（1）实验室的物理安全,分4级：P1P4级。,（2）实验室的生物安全,分3 级（大肠杆菌）：EK1EK3级。,（3） 载体的安全,应该是失去了自我迁移的能力。,Genentech的骄人业绩,
