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1、第2章 培养基及其制备,培养基及组成 淀粉水解糖制备 糖蜜与石油代粮发酵 前提物质、促进剂 原料处理,2.1 培养基的原材料,2.1.1 培养基的营养成分及来源 培养基是人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。根据微生物对营养的要求，培养基都基本包括碳源、氮源、无机盐、生长因子和水分，此外，还应根据微生物的要求，有一定的酸碱度和渗透压。,渗透压,渗透压当两种不同成分的溶液或不同浓度的溶液放在一起时，即引起扩散作用，直至成为均一溶液为止。如将两种溶液用羊皮纸或其他类似的半渗透膜隔开，则两种溶液因性质不同可由一方渗透到另一方，结果产生一种压力称为渗透压，这种现象称为渗透现象。渗
2、透压的大小依溶液中溶质的分子数目而定，分子数目越多则压力越大（如细胞质壁分离现象）。在同一重量百分浓度的溶液中，具有小分子溶质较具有大分子溶质的渗透压要大，离子溶液较分子溶液的渗透压大，所以盐类溶液的渗透压大于糖类溶液的渗透压。,渗透压对微生物有很大影响，微生物的生活环境必须具有与其细胞大致相等的渗透压，超过一定限度或骤然改变渗透压对微生物是有害的，甚至引起微生物死亡。微生物在高渗透压溶液中引起细胞脱水，原生质收缩，细胞质变稠，发生质壁分离，影响微生物的活动或使之死亡。一般微生物在高渗透压溶液中不能生长繁殖，所以，常用腌渍（530的食盐）或蜜饯（3080糖）来保存食品。微生物在低渗透压溶液中水
3、分向细胞内渗透，细胞吸水膨胀，甚至破裂，细胞质从细胞内排出。,工业培养基配制的意义,培养基成分和配比合适与否，对微生物生长发育、物质代谢、发酵产物的积累以及生产工艺都有很大的影响。良好的培养基配比可以充分发挥菌种的生物合成能力，以达到最良好的生产效果；相反，若培养基成分、配比或原材料不合适，则菌种生长及发酵的效果就较差。因此，在发酵工业生产上，必须重视培养基的选择及组成。,1.碳源,凡可构成微生物细胞和代谢产物中碳素来源的营养物质，统称为碳源。因为微生物细胞的原生质体（细胞内碳架结构）以及几乎所有的代谢产物都是含有碳素的有机物质，碳源是微生物细胞壁、荚膜和细胞贮藏物质的主要构成成分，再加上绝大
4、多数微生物的碳源可以兼作能源。所以，碳源不仅需要量大，而且是组成培养基的最基本的营养要素。,最常用的碳源,葡萄糖是碳源中最易利用的糖，几乎所有微生都利用葡萄糖，所以葡萄糖常作为培养基的一种主要成分。但是过多的葡萄糖会过份加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间产物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，如丙酮酸、乳酸、乙酸等，导致pH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成,其他的碳源,淀粉、糊精等多糖也是常用的碳源，它们一般都要经酶水解成单糖后再被吸收利用。有些微生物还可直接利用玉米粉、薯干、麸皮。此外，有机酸（如富马酸、醋酸）、醇类、脂类等亦可作为碳源，有机
5、酸的利用会使pH上升。,2.氮源,凡可构成微生物细胞的蛋白质、核酸、酶等或其代谢产物中氮素来源的营养物质，统称为氮源。它们为微生物的菌体蛋白和核酸等结构的形成提供主要组成成分。 工业上氮源的来源十分丰富，在选择氮源时，应当注意根据生产的实际结合每种氮源的特性作出选择。,常见氮源及其特点,无机氮源：氨、硫酸铵、硝酸铵等。利用快速（包括生理酸性氮源（NH4）2SO4，经微生物代谢后形成酸性物质和生理碱性氮源NaNO3） 有机氮源：利用缓慢，包括蛋白胨、牛肉膏、花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉、麸皮水解液、尿素 黄豆饼粉：水分11%，总氮11.2%，类脂物0.6%，总糖30%，灰分6.5% 麸皮水
6、解液：可以代替玉米浆，但蛋白质、氮基酸等营养成分比玉米浆少 尿素：菌体必须含脲酶方可使用 氨水：是一种无机氮源，目前常在生产中使用高浓度液氨，注意：因分解，容易带来pH波动的问题。,3.无机盐类 无机盐类是构成微生物菌体的重要成分，在调节微生物生命活动方面也起着很大的作用。无机盐类可分为主要元素和微量元素两大类，主要元素有P、S、Mg、K、Ca等，微量元素有Fe、Cu、Zn、Mn等。在制备培养基时，通常加入K2HPO4（或KH2PO4）、MgSO4就可满足，微量元素从天然物、自来水中就可以满足。,4.生长因子 凡能调节微生物代谢活动的微量有机物，统称为生长因子，一般指B族维生素，也有氨基酸、嘌
7、呤和嘧啶。 在微生物的科研和生产中，酵母膏、玉米浆、肝脏浸出液等，通常被作为生长因子的来源物质。事实上，许多作为碳源和氮源的天然成分，如麦芽汁、牛肉膏、麸皮、米糠、土豆汁等本身就含有极为丰富的生长因子，一般在这类培养基中，无需再另外添加生长因子。,5.水 水是微生物体内和体外的溶媒，营养物质只有溶解于水才能被细胞吸收；代谢产物也只有通过水才能排出菌体外。水还能调节细胞的温度。,2.1.2 培养基的类型,1.根据营养物质的不同来源分为： 天然培养基、合成培养基、半合成培养基 （1）天然培养基(natural medium)：用各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质（如牛肉膏、酵母膏、麦
8、芽汁、米曲汁、蛋白胨等）以及天然的含有丰富营养的有机物质（如马铃薯、玉米粉、麸皮、花生饼粉等）制成的培养基。发酵工业中普遍使用，优点是配制方便、经济、营养丰富，适合于微生物生长。但是，它的化学成分不清楚或不稳定（受产地、品种、保存加工方法等因素影响）。,（2）合成培养基(synthetic medium)：使用成分完全了解的化学药品配制而成的培养基称为合成培养基。合成培养基的优点是：化学成分明确、稳定，重复性好，但价格较贵，培养的微生物生长较慢。适用于实验室进行微生物生理、遗传育种及高产菌种性能的研究。在生产某些疫苗过程中，为防止异性蛋白等杂质混入，也经常使用。培养放线菌的高氏一号培养基和培养
9、真菌的察氏培养基都属于合成培养基。,（3）半合成培养基(semi-defined medium)：以天然的有机物作为碳、氮源及生长因子的来源，并适当加入一些化学药品以补充无机盐成分，使其更能充分满足微生物对营养的需求。例如，培养真菌用的马铃薯蔗糖培养基等。此类培养基特点是配制方便、成本低、微生物生长良好、应用很广、大多数微生物都能在此类培养基上生长。发酵生产和实验室中应用的大多数培养基都属于半合成培养基。,2.根据培养基的用途 基础培养基、增值培养基、鉴别培养基、选择培养基等 （1）基础培养基(Minimal Medium，MM)：又称最低限度培养基，指能满足某菌种的野生型（原养型）菌株最低营
10、养要求的合成培养基。不同微生物的基础培养基很不相同，有的极为简单，如大肠杆菌的基本培养基；有的极为复杂，如一些乳酸菌、酵母菌或梭菌的基本培养基。基本培养基有时也需要添加生长因子等。 若在基础培养基中加入富含氨基酸、维生素、碱基等生长因子的营养物质，如蛋白胨、酵母膏等，就可满足各种营养缺陷型的生长需求，这种培养基称为完全培养基(Complete Medium，CM)。 若在基础培养基中只是针对性地加入一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型生长，那么，这种培养基称为补充培养基(Supplement Medium,SM)。,（2）增殖培养基(enriched medium)：又名富集培养基。富集
11、培养基是在普通培养基中加入血、血清、动(植)物组织液或其它营养物(或生长因子)的一类营养丰富的培养基。它主要用于培养某种或某类营养要求苛刻的异养型微生物，或者用来选择性培养(分离、筛选、富集)某种微生物。具有助长某种微生物的生长，抑制其它微生物生长的功能。广义上讲，保藏培养基和鉴别培养基也属于富集培养基。,（3）鉴别培养基(differential medium)：在培养基中添加某种或某些化学试剂后，某种微生物生长过程中产生的特殊代谢产物会与加入的这些化学物反应，依靠指示剂的显色反应，借以鉴别不同种类的微生物。这种培养基称为鉴别培养基。 例如：用于检测饮水、乳品中是否含肠道致病菌的伊红-美兰乳
12、糖培养基，即EMB(Eosin Methylene Blue)培养基。其成分是：蛋白胨10克，乳糖10克，K2HPO4 2克，2%伊红 20ml，0.325%美兰20ml, 蒸馏水1000ml, pH7.2。,伊红-美兰乳糖培养基,其中的伊红和美兰两种苯胺染料可以抑制革兰氏阳性菌和一些难培养的革兰氏阴性菌。试样中的多种肠道菌会在EMB培养基上产生相互易区分的特征菌落，因而易于辨认。尤其是大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量混合酸，使菌体带H+，很容易染上酸性染料伊红，伊红又与美兰结合，其复合物为黑色，所以，大肠杆菌的菌落呈紫黑色并带金属光泽，其菌落较小。产气杆菌产酸弱，菌落呈棕色；变形杆菌不能
13、发酵乳糖，菌落无色、透明。,（4）选择培养基(selected medium)：根据某种或某类微生物的特殊营养要求，或对某些物理、化学条件的抗性而设计的培养基，称为选择性培养基。目的是利用这种培养基把某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。常用抑菌剂或杀菌剂（如染色剂、抗菌素等）抑制不需要菌的生长，而促进某种需要菌的生长。,3.根据培养基的物理形状分为 液体培养基、固体培养基、半固体培养基 （1）液体培养基(liquid medium)：各营养成分按一定比例配制而成的水溶液或液体状态的培养基称为液体培养基。工业上绝大多数发酵都采用液体培养基。实验室中微生物的生理、代谢研究和获取大量菌体是
14、也常利用液体培养基。,（2）固体培养基(solid medium)：在液体培养基中加入加入一定量的凝固剂（如琼脂、明胶等）配制而成的固体状态的培养基。固体培养基在科学研究和生产实践中具有很多用途，例如它可用于菌种分离、鉴定、菌落计数、检测杂菌、选种、育种、菌种保藏、抗生素等生物活性物质的效价测定及获取孢子等。在发酵工业也中常用固体培养基进行固体发酵。,凝固剂,琼脂(Agar)是最好的凝固剂。它是从海藻中提取的多糖类物质，主要由琼脂糖(agarose)和琼脂胶(agaropectin)两种多糖组成。除极少数菌外，大多数微生物无法降解琼脂。琼脂 45固化，约100才融化。灭菌过程中不会被破坏，并且
15、价格低廉。培养基中加0.5%琼脂时可以获得半固体培养基，加入1.5%-2.0%琼脂即成固体培养基，加8%琼脂则成硬固体培养基。 明胶(Gelatin)也是一种凝固剂。它是由动物的皮、骨、韧带等煮熬而成的一种蛋白质，含有多种氨基酸，可被许多微生物作为氮源而利用。明胶20凝固，2835融化，所以，只能在20-25温度范围作凝固剂使用，适用面很窄，但可用于特殊检验。 硅胶(Silica gel)是无机硅酸钠(Na2SiO3)和硅酸钾(K2SiO3)与盐酸和硫酸中和反应时凝结成的胶体。因为它完全无机，在研究分离自养菌时用作培养基的凝固剂。硅胶一旦凝固后，就无法再融化。,（3）半固体培养基(semi-s
16、olid medium)：半固体培养基是指琼脂加入量为0.2-0.5%而配制的固体状态的培养基。半固体培养基有许多特殊的用途，如可以通过穿刺培养观察细菌的运动能力，进行厌氧菌的培养及菌种保藏等。,4.根据培养基在发酵生产中的不同用途分为 繁殖和保藏培养基 、种子培养基、发酵培养基等 （1）繁殖和保藏培养基(reproducible medium)：主要用于微生物细胞生长繁殖和保藏，大部分情况下就是斜面培养基，包括细菌、酵母菌等的斜面培养基以及霉菌、放线菌产孢子培养基或麸曲培养基等。 注意：富含有机氮源，少含碳源；所用无机盐的浓度要适量；pH和湿度要适中。,（2）种子培养基(seed culture medium)：种子培养基是适合微生物菌体生长的培养基，目的是为下一步发酵提供数量较多，强壮而整齐的种子细胞。 一般要求氮源、维生素丰富，氮源含量高些，总浓度稀薄；碳源少量，若糖分过多，菌体代谢活动旺盛，产生有机酸，使pH下降，菌种容易衰老；种子培养基成分应与发酵培养基的主要成分相近，以缩短发酵阶段的适应期（延滞期）
