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1、第四章 微生物的生理,五、微生物的培养基,培养基是人工根据微生物得营养要求，将水、碳源、氮源、无机盐、生长因子等物质按照一定得比例配制的，用以培养微生物（生长繁殖或产生代谢产物）的营养基质。,培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础。任何培养基都应该为微生物生长提供五大营养要素。 任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌，否则很快引起杂菌丛生，并破坏其固有成分和性质。,(一)、配置培养基的顺序和原则,目的明确,营养协调,理化条件适宜,经济节约,2.配置培养基的原则,1.配置培养基的顺序,各成分的顺序：1).缓冲化合物；2).无机元素； 3).微量元素；4).生长因子。最后调节pH。,无菌,
2、3).营养协调,培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用。,培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（C/N）的影响较大。,2).目的明确,根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基。根据培养微生物的目的决定成分的量。如培养目的为了得到大量的菌体,氮源要高,有利于菌体蛋白质合成。,1).无菌,例如，在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中，培养基碳氮比为4/1时，菌体量繁殖，谷氨酸积累少；当培养基碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。,培养基
3、的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型 微生物的生长繁殖或产生代谢产物。,通常培养条件： 细菌与放线菌：pH77.5 酵母菌和霉菌：pH4.56范围内生长,为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入 pH缓冲剂，如K2HPO4、(NH4)2SO4、碳酸盐或在进行工业发酵时补加酸、碱。 有些缓冲剂既可调节pH也是营养物质。,4).理化条件适宜 pH,(二) 、培养基的类型及应用,培养基种类繁多，根据其成分、物理状态和用途可将培养基分成多种类型。,按成分不同划分,纯生物制品(细胞提取物) 如，常用的牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g水 1000mL pH 7.27.4 麦芽
4、汁培养基 牛肉膏瘦牛肉经过加热浓缩抽提的膏状物（主要作碳源）蛋白胨动植物蛋白（大豆或动物骨粉等）经初步酶解形成的短肽（主要作氮源）优点营养丰富、配制容易 缺点：质量不稳定、选择性差；,化学成分完全了解的物质配制而成的培养基优点稳定、选择性 缺点很多细菌营养需求较为复杂，配方获取较难,天然培养基,合成培养基,复合培养基,无机物+有机物 优缺点介于前两者之间，因而使用最广。,按物理状态不同划分,在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态，琼脂含量一般为1.5%3.0%,琼脂含量一般为0.3%0.5%,不加任何凝固剂,固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏,观察微生物的运动
5、特征、分类鉴定,大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究,琼脂主要成份半乳聚糖，分子量大，呈网状粘着力强，溶解分散（温度为96以上）,琼脂特性,A.不能被绝大多数微生物利用、分解液化； 提问：有什么好处？ 不作为额外碳源，干扰试验，保持固体特性 B.高压灭菌结构不被破坏，且颜色透明不妨碍观察；,C.多数微生物在琼脂培养基表面生长并形成独立菌落；,提问：有何好处？ 易于纯化分离,用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基,用于鉴别不同类型微生物的培养基,在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基,按用途不同划分,牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基
6、础培养基,选择培养基： 选择性？ 待选的细菌能优势生长 利用微生物对某些物质的敏感程度不同，在培养基中加入一些敏感物质，这样就可以利用这些物质来抑制非目的性微生物的生长，从而使得所需的微生物大量繁殖。, 投毒法,常用物质为染料、胆汁酸盐、金属盐类、酸、碱和抗生素。 例如欲分离古细菌，培养基中通常加入青霉素，古细菌就唯一分离并存活下来。,胆汁酸盐抑制革兰氏阳性菌 能选择性生长革兰氏阴性细菌,毒选择性的抑制剂 待选细菌有抗性,投其所好法,好营养、环境因子 （1）专一性营养源培养法 待选细菌专门需要的某种碳源或氮源 例如筛选纤维素分解菌选用纤维素作为培养基中的唯一碳源. 各类降解石化废水特殊有机物的
7、细菌筛选通常是以这类有机物为培养基中的唯一碳源，将目的细菌富集筛选下来。,（2）理化因素控制法 理化因素特殊的温度、氧气、pH、盐度等环境条件 主要用于筛选极端环境微生物。如嗜盐、嗜热、嗜冷、嗜酸、嗜碱等的细菌，同时也被用于选择性培养好氧或厌氧细菌。,鉴别培养基： 利用几种细菌对某一物质的分解能力不同，借助指示剂的显色不同进行菌种鉴别和区分的培养基。 方法？ 鉴加入指示剂 别不同菌落制造不同的代谢物，显色不一 水处理中常用的EMB(伊红美蓝)培养基就是典型大肠菌群内不同种属细菌的鉴别培养基：大肠杆菌中的大肠埃希氏菌、柠檬酸盐杆菌、克雷伯氏菌、产气杆菌四个，对乳糖的分解能力不同。 其中大肠埃希氏
8、菌最强，菌落呈紫红色且带金属光泽；枸橼酸盐杆菌次之，菌落呈紫红色或深红色；产气杆菌最低，菌落呈淡红色。,EMB培养基,1.认识,化能自养菌氧化硫杆菌的培养基 粉末状硫 10g KH2PO4 4g MgSO4 0.5g CaCl2 0.5g (NH4)2SO4 0.4g FeSO4 0.01g 水 1000mL（自来水即可）,提问：其中各组分作用是什么？,空气中的CO2,能源,磷源、缓冲物,碳源是什么？,氮源,盐,也可补加一部分碳酸钠。,异养细菌的培养基中至少有一种有机物，实验室中通常是葡萄糖 如一种大肠杆菌培养基 葡萄糖 0.5g K2HPO4 1g MgSO4 0.2g NaCl 5g NH
9、4H2PO4 0.4g 水 1000mL,2.配制,通常,加水,（二）根据培养基组分,天然培养基、合成培养基和半合成培养基。 1）合成 合成纯化学试剂,2）天然 天然？ 纯生物制品(细胞提取物) 如，常用的细菌肉汤培养基 牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 水 1000mL pH 7.27.4 牛肉膏瘦牛肉经过加热浓缩抽提的膏状物（主要作碳源）,优点稳定、选择性 缺点很多细菌营养需求较为复杂，配方获取较难,六、营养物质进入细胞的方式,对绝大多数属于渗透营养型的微生物来说，营养物质通过细胞膜进入细胞的问题，是一个较复杂又很重要的生理学问题。 细胞壁在营养物质运送上不起多大作用，仅简单地排阻分子量过大（6
10、00Da）的溶质的进入，细胞膜则是控制营养物进入和代谢产物排出的主要屏障。 细胞膜以四种方式控制物质的运送，即单纯扩散（被动扩散）、促进扩散、主动运送和基团移位（基团转位），其中尤以主动运送为最重要。,1单纯扩散（也称被动扩散、被动运送）,细胞膜这层疏水性屏障可以通过物理扩散方式让许多小分子、非电离分子尤其是亲脂性的分子被动地通过，这就是单纯扩散。这类物质的种类不多，主要是氧、二氧化碳、乙醇和某些氨基酸分子，还没有发现过糖分子可通过单纯扩散而进入细胞的例子。 推动力：浓度梯度，不消耗能量。 单纯扩散不是细胞获取营养物质的主要方式，因为细胞既不能通过它来选择必需的营养成分，也不能将稀溶液中的溶质
11、分子进行逆浓度梯度运送，以满足细胞的需要。,水、无机盐、氧气、乙醇等小分子,被动扩散,?,推动力?,推动力浓度梯度,无载体蛋白,不消耗能量,内部能量消耗YorN?,与单纯扩散的一个主要差别，是在溶质的运送过程中，必须借助于膜上底物特异性载体蛋白的参与。由于参与的方式不同，载体蛋白还有许多其他名称，例如透性酶、移位酶等。这种载体蛋白运送溶质的机制是由于其构象的改变：在膜的外侧时，它能与溶质分子结合，而在膜的内侧则可释放此溶质，且不必提供任何能量。这类载体蛋白具有酶的性质，而且必须是诱导产生的。促进扩散只能把环境中浓度较高的分子加速扩散到细胞内，直至膜两侧的溶质浓度相等时为止，而决不能引起溶质的逆
12、浓度梯度运送。因此，它只对生长在高营养物浓度下的微生物发挥作用。,2促进扩散,促进扩散,促进载体蛋白协助,载体蛋白,细胞外,|,细胞膜,|,细胞内,糖、氨基酸、硫酸根、磷酸根等,?,推动力浓度梯度,有载体蛋白,不,内部能量消耗YorN?,推动力?,3主动运输,是微生物吸收营养物质的主要机制。其特点是它的特异性载体蛋白在运送溶质的过程中，需要提供能量（质子势、ATP等）而发生构象变化；同时，它可逆浓度梯度进行运送，从而使生活在低营养环境下的微生物能获得浓缩形式的营养物。由主动运送的营养物主要有无机离子、有机离子和一些糖类（例如乳糖、葡萄糖）等。,主动运输,运输载体蛋白 主动逆浓度梯度方向,乳糖、
13、氨基酸、有机酸 、 Na+、K+等,?,推动力ATP放能,有载体蛋白,消耗,内部能量消耗YorN?,推动力?,细菌吸收营养物质的最主要方式。,4基团转位,也是一种既需特异性载体蛋白又须耗能的运送方式，但溶质在运送前后会发生分子结构的变化，因而不同于上述的主动运送。 基因移位主要用于运送葡萄糖、果糖、甘露糖、核苷酸、丁酸和腺嘌呤等物质。以葡萄糖为例，其特点是每输入一个葡萄糖分子，就要消耗一个ATP的能量。运送的机制是依靠磷酸转移酶系统，即磷酸烯醇式丙酮酸-己糖磷酸转移酶系统。,提问：磷酸化的益处？ （一）直接完成代谢前活化 （二）防止营养物从细胞内流失； （三）保持营养物在细胞内的低浓度,糖(葡
14、萄糖、甘露糖、果糖及糖的衍生物N乙酰葡萄糖胺)、嘌呤、嘧啶、脂肪酸,?,磷酸烯醇式丙酮酸放能,有载体蛋白,消耗能量,内部能量消耗YorN?,推动力?,视情况，以能量最省选择方式,四种运输方式比较,第三节 微生物的产能代谢,同化 作用,新陈代谢,异化 作用,吸收能量，进行合成代谢，将吸收的营养物质转变为细胞物质。又称合成代谢。,产生能量,需要能量,分解反应，放出能量，将自身细胞物质和细胞内的营养物质分解的过程。又称分解代谢。,微生物生长繁殖需要营养，合成细胞需要能量，最终靠产能代谢提供。微生物的产能代谢主要讨论的是微生物的分解代谢。,一、产能代谢与呼吸的关系,呼吸本质：氧化还原的统一过程。其中有
15、能量的产生与转移。 呼吸类型：发酵、好氧呼吸、无氧呼吸 在呼吸过程中，都会发生电子转移。提供电子的物质被氧化，接受电子的物质被还原。 所谓的产能代谢就是通过三种呼吸来实现的。,一、产能代谢与呼吸的关系,微生物产能种类： 1.电能：电子转移产生的能量； 2.化学能：物质反应（氧化）过程中释放的能量； 3.机械能：鞭毛运动、细胞质流动等产生的能量； 4.光能：发光菌产生的能量。 这些能量有的被用于生化反应，有的以热量的形式散发，有的被贮存在ATP中。,一、产能代谢与呼吸的关系,ATP生物能量转移中心 物质氧化放出能量 细胞合成需要能量,ATP是在发酵、好氧呼吸、无氧呼吸中形成。具体方式： 1.底物
16、水平磷酸化 厌氧微生物或兼性微生物的底物被氧化，会产生高能中间体，并把高能键（）交给ADP，从而形成ATP。 2.氧化磷酸化 好氧微生物呼吸，通过电子传递体系形成ATP。 3.光合磷酸化 光可引发叶绿素、菌绿素等放出电子，电子在被传递过程中形成ATP。,ATP含有高能磷酸键（31.4KJ），但仅是能量的暂时贮存物质，如果能量确实过剩，不能用ATP，而用其他内含颗粒来长期贮存。,二、呼吸类型 根据最终电子受体可将微生物呼吸分为：发酵、好氧呼吸、无氧呼吸三种。,1.发酵 是指在无氧条件下，底物脱氢后所产生的还原力H不经过呼吸链传递而直接交给某一内源氧化性中间代谢产物的一类低效产能反应。 这个过程，能量有少量释放，多数仍保留在产物中。 以葡萄糖为例，酵解发酵。 葡萄糖被分解的过程称为糖酵解过程，也称EMP途径或E-M途径。 糖酵解几乎是所有具有细胞结构的生物所共有的主要代谢途径。,糖酵解分为两大步骤： （1）预备
