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1、喹诺酮类药物残留检测方法,深圳出入境检验检疫局 岳振峰 ,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,2,主要内容,1 概述 2 常见检测方法 3 高效液相色谱法（HPLC） 4 液相色谱串联质谱法(LC/MS/MS),2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,3,1 概述1.1 喹诺酮类药物的分类,喹诺酮类（quinolones, QNs）抗菌药是指人工合成的含有吡酮酸（1,4-二氢-4-氧吡啶-3-羧酸）基本结构的一类抗菌药物。按母环的差异可分为喹啉类、萘啶类、吡啶并嘧啶类和噌啉类；按其发展历史，目前可分为三代药物。,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,4,第一代：萘啶酸、恶喹酸和吡咯
2、酸，由于抗菌谱窄、半衰期短、毒副作用强和细菌耐药性等原因，现已很少应用； 第二代：吡哌酸和氟甲喹； 第三代：沙拉沙星、单诺沙星、恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、二氟沙星、麻保沙星等氟喹诺酮类（fluoroquinolones，FQs），由于抗菌谱广、抗菌作用强，已逐渐成为该类药物的主流。,1 概述1.1 喹诺酮类药物的分类,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,5,1 概述1.2 氟喹诺酮类药物的结构,氟喹诺酮类药物的共同特点是喹啉环（个别为萘啶环）的C-6位上有氟原子，C-7位上连接哌嗪基或吡咯基，又称为6-氟喹诺酮类。,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,6,1 概述1.
3、3 喹诺酮类药物的性质,QNs均为白色或淡黄色晶型粉末，游离酸形式一般易溶于稀碱、稀酸溶液和冰醋酸，在pH6-8的水中溶解度最小，在多数有机溶剂中难溶或不溶。 QNs在C-3位含有羧基，在C-7位连接哌嗪等含氮碱性基团，因此属酸碱两性化合物，这也是设计提取、净化和分离方法的主要依据。 QNs结构中含有苯并杂环或并杂环骨架和羰基、羧基、杂原子等组成的共轭系统，在紫外区具有特征性和强的吸收；在酸性介质中具有较强的稳定荧光性质；对光照、温度和酸/碱具有较好的稳定性。,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,7,1 概述1.3 喹诺酮类药物的药理学与毒理学,QNs对革兰氏阴性菌、支原体和一些革兰氏阳
4、性菌具有强大的杀灭作用，组织渗透能力强，毒副作用低。可用于呼吸道、肠道、泌尿、皮肤和深部组织感染或败血症的治疗。,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,8,1 概述1.3 喹诺酮类药物的药理学与毒理学,但QNs同时也是人类最有效的抗菌药之一，由于细菌对喹诺酮类药物耐药性的产生和某些喹诺酮类药物的潜在致癌性质，其残留问题已引起广泛关注。 2003年我国的鳗鱼产品就曾因氟喹诺酮类药物残留问题出口日本受阻。 包括我国在内的许多国家和地区都对喹诺酮类药物的使用范围和最大残留限量做出规定，根据不同动物品种和药物种类，MRL在301900g/kg之间。,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,9,1
5、 概述1.4 喹诺酮类药物的代谢与残留,QNs在动物体内分布很广，一般肝、肾组织中浓度最高，肌肉、血浆中浓度最低。 QNs主要经肾和胆管排泄，故尿液或胆汁中药物浓度较高；另外QNs可以代谢进入毛发而长期存在，氟甲喹和恶喹酸可进入骨骼组织而蓄积。 组织中QNs残留物主要是原形药物，一般选择原形药物作为残留标示物；但恩诺沙星的残留标示物为恩诺沙星及其主要代谢产物环丙沙星。,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,10,2 常见测定方法,微生物抑制法 酶联免疫法 放射免疫法 HPLC法 LC/MS/MS法,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,11,3 高效液相色谱法（HPLC）3.1 原理及
6、适用范围,将均质样品以1%醋酸-乙腈溶液提取喹诺酮类药物残留，提取液用正已烷净化。用配有荧光检测器的高效液相色谱仪测定。适用于畜、禽、水产品组织中氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、丹诺沙星、沙拉沙星、氟甲喹的同时检测。,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,12,3 高效液相色谱法（HPLC）3.2 检测流程,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,13,-加入15 mL 1%醋酸-乙腈溶液， 均质1 min后放入超声波池中超声5 min,3500 r/min, 离心5 min,合并上清液,残渣,上清液,重复提取1次,上清液,3 高效液相色谱法（HPLC）3.2 检测流程,2020/7/30
7、,岳振峰-SZCIQ ,14,15 mL乙腈饱和正己烷脱脂净化,乙腈层,弃去正己烷层,3 高效液相色谱法（HPLC）3.2 检测流程,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,15,于45水浴中旋转蒸发近干，用氮气吹干,3 高效液相色谱法（HPLC）3.2 检测流程,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,16,-在残渣中加入2 mL HPLC流动相2，快速混匀和超声3 min溶解残渣； -2mL正己烷脱脂，弃去正己烷层； -注射器滤膜（0.45 m）过滤。,3 高效液相色谱法（HPLC）3.2 检测流程,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,17,HPLC-FLD,3 高效液相色谱法（
8、HPLC）3.2 检测流程,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,18,色谱柱：4.0 mm250 mm5 m，Hyprsil ODS 柱温：30；进样量：20L A.- 0.01mol/L磷酸盐/三乙胺缓冲液（80+20） （pH3.0） B - 乙腈；流速：0.8ml/min,3 高效液相色谱法（HPLC）3.3 色谱条件,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,19,检测波长：,3 高效液相色谱法（HPLC）3.3 色谱条件,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,20,3 高效液相色谱法（HPLC）3.4 色谱图,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,21,种喹诺酮类药物的
9、测定低限(LOQ)均为15 g/kg。 种喹诺酮类药物的线性范围均为：1050g/kg。 种喹诺酮类药物的回收率为64%-106.3%；相对标准偏差为1.3%-9.5%。,3 高效液相色谱法（HPLC）3.5 方法的性能指标,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,22,试样中的喹诺酮类药物残留用酸性乙腈溶液提取，经正己烷脱脂净化，浓缩、定容后，用液质联用仪测定，子离子丰度比定性，外标峰面积法定量。 适用于肌肉、肝脏、水产品、奶等动物源性食品中萘啶酸、恶喹酸、氟甲喹、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、洛美沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星、麻保沙星、培氟沙星、司帕沙星、奥比沙
10、星等16种喹诺酮类兽药残留的定性确证和定量测定。, 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）3.1 原理及适用范围,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,23, 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）3.2 检测流程,LC/MS/MS分析,溶解、脱脂、过滤,旋蒸至近干、氮气吹干,215 mL1%醋酸-乙腈溶液提取,5g样品,正己烷净化,-在残渣中加入5 mL 流动相，快速混匀和超声3 min溶解残渣； -5mL正己烷脱脂，弃去正己烷层； -注射器滤膜（0.45 m）过滤。,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,24, 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）3.2 检测流程,LC/MS/M
11、S分析,溶解、脱脂、过滤,旋蒸至近干、氮气吹干,215 mL1%醋酸-乙腈溶液提取,5g样品,正己烷净化,LC/MS/MS ，ESI+ ，MRM模式检测,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,25, 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）3.3 仪器条件,液相色谱条件 色谱柱：Inertsil C8-3，5 m，150 mm2.1 mm i.d.或相当者； 流动相：0.1%甲酸的乙腈溶液+0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脱（梯度时间表见表1）； 流速：300 L/min； 柱温：30 ； 进样量：30 L。,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,26, 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS
12、）3.3 仪器条件,液相色谱条件,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,27, 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）3.3 仪器条件,质谱条件 离子化模式：ESI+； 质谱扫描方式：MRM； 分辨率：单位分辨率； 雾化气（NEB）：6.00 L/min；气帘气（CUR）：12.00 L/min；喷雾电压（IS）：5 000 V；去溶剂温度（TEM）：500 ；去溶剂气流7.00 L/min；碰撞气（CAD）：6.00 mL/min（氮气）。 其它质谱参数见表2。,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,28, 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）3.3 仪器条件,质谱条件,2020/
13、7/30,岳振峰-SZCIQ ,29, 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）3.4 重构离子色谱图,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,30, 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）3.4 重构离子色谱图,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,31, 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）3.5 方法的性能指标,16种喹诺酮类药物残留的测定低限均为10.0 g/kg。 本方法的平均回收率为：鸡肉71.9% -102 %、鸡肝66.4%-102%、鱼肉62.4%-89.6%、牛奶68.7%-104%，相对标准偏差为：鸡肉1.5% 11.9 %、鸡肝2.7%-9.1%、鱼肉1.4%-11.4%、牛奶4.1%-12.7%。,2020/7/30,岳振峰-SZCIQ ,32,谢谢！,
