《中国药科大学生化设计性实验报告参考——菠萝蛋白酶的提取和活力测定课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中国药科大学生化设计性实验报告参考——菠萝蛋白酶的提取和活力测定课件（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、项目一,从菠萝中提取菠萝蛋白酶,微生物09301班第三实验小组 成员：徐雨婷 杨洋 刘杨 何威 刘鄂龙,一、实验目的1、掌握从原料物中提取分离目的蛋白酶；2、掌握对目的蛋白酶质量的检验；3、学习酶比活力的计算；,二、实验基本原理 菠萝蛋白酶是一种具有消炎，抗水肿作用的疏基酶，能分解蛋白质、酯和酞胺。 菠萝蛋白酶一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取，为浅黄色无定形粉末，分子量33000，微有异臭，微溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿，乙醚，等电点9.55 。 本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀法提取出菠萝蛋白酶，然后通过考马斯亮蓝法测定酶制品中菠萝蛋白酶的总量，最后菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨
2、酸，通过在275nm波长下测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。,三、实验材料和试剂1、实验材料 新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白,2、实验试剂 柠檬酸钠 维生素c 单宁 0.1%EDTA溶液 1.5%氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化钠溶液 0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调PH至7.0） 激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含15mmol/L硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用）,四、实验器材和仪器,1、榨汁机； 2、离心机； 3、紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）； 4、恒温水浴锅（37）
3、； 5、试管、试管架； 6、烧杯、容量瓶； 7、移液管；,五、实验操作方法法和步骤,（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶 操作步骤：,将菠萝切碎,加柠檬酸钠，榨汁,菠萝汁,纱布过滤,澄清液,2000r/min，7min离心,上清液,沉淀物,酶复合物,酶复合物沉淀,加Vc,0.2%单宁溶液 搅拌15min,静置40min 4200r/min,5min离心,加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化钠液,4200r/min,5min离心,加适量1.5%氯化钠溶液，4000r/min,7min离心,冻存备用,（二）考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量,1、标准曲线的制作 按下表操作,根据上表，以
4、吸光度为纵坐标，标准蛋白质量为横坐标作图,根据线性拟合关系y=6.2357x,计算蛋白酶的质量,（三）菠萝蛋白酶活力的测定,1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.0)至10ml,离心得上清液； 2、取5支试管，分别标号1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶和0.9m激活剂； 3、另取5支试管，分别对应标号、，各加1ml缓冲液和0.9ml激活剂； 4、将10支试管置于37水浴； 5、然后按下表操作,6、按步骤5混匀，在37水浴下反应10 min;7、向10支试管中各加入8ml1mol/L的氢氧化钠溶液，摇匀，于室温放置30min;8、取各自对应的试管在275nm波长下测定吸光度9
5、、测定结果如下,由于吸光度在0.20.8之间较准确，故上述数据中可以选择第三组数据进行处理计算,（四）数据的处理,1、由线性关系y=6.2357x，可以计算酶制品中蛋白酶的总质量m=0.140/6.2357x5=0.1123mg 2、菠萝蛋白酶活力=0.868/10=0.0868U 3、比活力=0.0868U/0.1123mg=0.7729U/mg 4、提取率=0.1123mg/0.735kg=0.00001528% （五）结果讨论 从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有： 1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响； 2、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉淀析出； 3、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否合理； 4、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足，导致结果偏低；,5、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实验没有得到这种结果。6、活力测定中，由于操作不当，导致部分沉淀溶解在了上清液中，溶液微浑浊，对吸光度的测定有影响。,The end,
