《中国药科大学生化设计性实验报告参考——菠萝蛋白酶的提取和活力测定课件》由会员分享,可在线阅读,更多相关《中国药科大学生化设计性实验报告参考——菠萝蛋白酶的提取和活力测定课件(12页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、项目一,从菠萝中提取菠萝蛋白酶,微生物09301班第三实验小组 成员:徐雨婷 杨洋 刘杨 何威 刘鄂龙,一、实验目的1、掌握从原料物中提取分离目的蛋白酶;2、掌握对目的蛋白酶质量的检验;3、学习酶比活力的计算;,二、实验基本原理 菠萝蛋白酶是一种具有消炎,抗水肿作用的疏基酶,能分解蛋白质、酯和酞胺。 菠萝蛋白酶一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取,为浅黄色无定形粉末,分子量33000,微有异臭,微溶于水,不溶于乙醇、丙酮、氯仿,乙醚,等电点9.55 。 本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸(单宁)沉淀法提取出菠萝蛋白酶,然后通过考马斯亮蓝法测定酶制品中菠萝蛋白酶的总量,最后菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨
2、酸,通过在275nm波长下测定吸光度的变化,可以测得菠萝蛋白酶的活力。,三、实验材料和试剂1、实验材料 新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白,2、实验试剂 柠檬酸钠 维生素c 单宁 0.1%EDTA溶液 1.5%氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化钠溶液 0.05mol/L磷酸缓冲液(溶解磷酸二氢钾,加氢氧化钾调PH至7.0) 激活剂(PH7.0,0.05mol/L磷酸缓冲液,内含15mmol/L硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用),四、实验器材和仪器,1、榨汁机; 2、离心机; 3、紫外可见分光光度计(1cm石英比色皿); 4、恒温水浴锅(37)
3、; 5、试管、试管架; 6、烧杯、容量瓶; 7、移液管;,五、实验操作方法法和步骤,(一)从菠萝中提取菠萝蛋白酶 操作步骤:,将菠萝切碎,加柠檬酸钠,榨汁,菠萝汁,纱布过滤,澄清液,2000r/min,7min离心,上清液,沉淀物,酶复合物,酶复合物沉淀,加Vc,0.2%单宁溶液 搅拌15min,静置40min 4200r/min,5min离心,加100ml0.1%EDTA溶液,200ml1.5%氯化钠液,4200r/min,5min离心,加适量1.5%氯化钠溶液,4000r/min,7min离心,冻存备用,(二)考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量,1、标准曲线的制作 按下表操作,根据上表,以
4、吸光度为纵坐标,标准蛋白质量为横坐标作图,根据线性拟合关系y=6.2357x,计算蛋白酶的质量,(三)菠萝蛋白酶活力的测定,1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液(PH7.0)至10ml,离心得上清液; 2、取5支试管,分别标号1、2、3、4、5,各加1ml溶液酶和0.9m激活剂; 3、另取5支试管,分别对应标号、,各加1ml缓冲液和0.9ml激活剂; 4、将10支试管置于37水浴; 5、然后按下表操作,6、按步骤5混匀,在37水浴下反应10 min;7、向10支试管中各加入8ml1mol/L的氢氧化钠溶液,摇匀,于室温放置30min;8、取各自对应的试管在275nm波长下测定吸光度9
5、、测定结果如下,由于吸光度在0.20.8之间较准确,故上述数据中可以选择第三组数据进行处理计算,(四)数据的处理,1、由线性关系y=6.2357x,可以计算酶制品中蛋白酶的总质量m=0.140/6.2357x5=0.1123mg 2、菠萝蛋白酶活力=0.868/10=0.0868U 3、比活力=0.0868U/0.1123mg=0.7729U/mg 4、提取率=0.1123mg/0.735kg=0.00001528% (五)结果讨论 从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低,可能的原因有: 1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响; 2、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉淀析出; 3、菠萝蛋白酶对热不稳定,试验中温度的控制是否合理; 4、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足,导致结果偏低;,5、在活力的测定步骤中,设置了几个梯度,最后的结果中应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同,但本组实验没有得到这种结果。6、活力测定中,由于操作不当,导致部分沉淀溶解在了上清液中,溶液微浑浊,对吸光度的测定有影响。,The end,