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1、免疫学检测与免疫学技术,一、抗原抗体的检测技术 二、免疫细胞的检测 三、细胞因子的检测 四、免疫相关基因分析 五、免疫标记技术 六、免疫PCR(IM-PCR)技术 七、杂交瘤技术与T细胞克隆技术 八、新型抗体的制备技术 九、抗原的制备技术,一、概述 免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。 免疫学技术的应用极为广泛,疾病的诊断、疗效评价及理论研究等。 二、抗原抗体的检测技术 *根据反应的基本原理与表现主要分为凝集反应、沉淀反应和补体参与的各种反应 *根据抗原抗体反应设计的试验还有标记抗原(或抗体)检测相应物
2、质的标记技术。,对机体参与免疫应答的细胞进行鉴定,计数及功能测定 (一)细胞计数 1. 荧光抗体染色 2. 免疫酶染色技术: *ABC法 *APAAP法 3. 免疫金银染色法(IGSS) 4免疫细胞化学法 5四聚体法 6TCR链测定,三、免疫细胞的检测,(二)免疫细胞功能的测定 1. T细胞功能测定：肿瘤，病毒感染，免疫缺陷，自身免疫病等 (1)细胞增殖(转化)试验：可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。 *丝裂原主要有PHA、Con A和PWM； *抗原刺激物有破伤风类毒素、PPD和白色念珠菌等； *同种MHC及抗CD3单抗等 *肿瘤细胞-自体淋巴细胞混合培养 (2)T细胞介导的细胞毒试验：
3、CTL (3)分泌功能检测 (4)T细胞功能的体内检测法 *接触性超敏反应*移植物抗宿主反应(GVHR) *迟发型超敏反应(DTH),2. B细胞功能判定 (1)B细胞增殖(转化)试验： *PWM、SAC，LPS（对小鼠B细胞）； *抗IgM抗体及EB病毒等 (2)溶血空斑形成试验 (3)反向溶血空斑试验 (4)酶联免疫斑点法(ELISPOT):ELISPOT是一种可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。 *此法的主要优点是: 稳定、特异，且抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量测定； 可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。,3. NK细胞活性测定 体外检测NK细
4、胞活性的方法有形态学检查法，放射性核素释放法，酶释放法，化学发光法及流式细胞术等。测定人NK细胞活性常以K562细胞株作为靶细胞，测定小鼠NK细胞活性常用YAC1 细胞为靶细胞。 (1)形态学检查法 (2)放射性核素释放法：用放射性核素(51Cr、125I UdR)标记靶细胞。 (3)酶释放法：测定靶细胞膜受损后从胞浆内释放至介质中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。 *NAG酶荧光比色法:NAG酶是细胞浆中存在的一种溶酶体酶,与其底物作用后,生成荧光产物,应用荧光分光光度计测定，敏感性明显高于LDH比色法。而且方法简单，结果稳定，重复性好。,(4)化学发光法 (5)流式细胞术：应用FCM检测NK细胞
5、活性是根据PI染料排斥法。PI渗入死亡细胞内与DNA和RNA结合，在488nm波长激发下产生绿色荧光。此法既可以测定单个细胞毒活性，也可以用于总细胞毒活性试验。 *还可利用荧光染料法,细胞光扫描法，双标记细胞毒法测定细胞毒性细胞的杀伤效应。,4吞噬细胞功能测定 (1)中性粒细胞趋化功能测定：一般采用滤膜渗透法(Boyden小室法)或琼脂糖平板法。 (2)中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定 1)显微镜检法 2)NBT试验：此项试验是测定中性粒细胞吞噬、杀菌功能的一种简易方法。 3)化学发光测定法：中性粒细胞在吞噬过程中出现呼吸爆发,产生活性氧代谢产物。此类活性氧化基团与细胞内杀菌作用密切相关，同时又能
6、激发细胞内某些物质产生化学发光。,(4)巨噬细胞细胞毒测定:通常取小鼠腹腔巨噬细胞，以-干扰素为激活剂使其活化，作为效应细胞。用125I-UdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815作为靶细胞。 (3)巨噬细胞吞噬功能测定：中药斑蝥酒精浸液敷贴法诱发无菌性皮炎，从皮肤水泡渗出液中收集巨噬细胞，在体外进行鸡红细胞吞噬试验，计算吞噬率和吞噬指数，作为判断巨噬细胞吞噬功能的指标。,四、细胞因子的检测,（一）免疫学检测法 免疫学检测的基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。如免疫斑点法、ELISA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。某些细胞因子含量甚微的样品(如脑脊液)可用免疫聚合酶链
7、反应(immuno-PCR)进行检测。,（二）生物学测定法 根据细胞因子对特定的生物学活性,应用相应的指示系统,同时与标准品对比测定,从而得知样品中细胞因子的活性水平,一般以活性单位(U/ml)表示。 靶细胞可直接从组织中分离,如骨髓细胞的集落形成试验和胸腺细胞(脾细胞)的增殖试验,或用体外培养的依赖细胞因子才能生长的细胞因子依赖株及对细胞因子杀伤敏感的细胞作为靶细胞。,1. 促进细胞增殖和增殖抑制法 *多种IL、表皮生长因子、转化生长因子、神经生长因子、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子 *各种CSF作用于造血系统的不同细胞,可促进其增殖及在半固体琼脂凝胶系统中克隆
8、培养骨髓细胞的集落形成,故可采用集落形成试验研究CSF的水平 *常用的检测细胞增殖的方法有3H-TdR掺入法、比色法、染色法和直接计数法等。其中测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的比色法包括 MTT、XTT、MTS和NAG等方法。,2. 细胞毒活性测定法 许多细胞因子(TNF)针对转化的细胞及病毒感染的细胞具有溶细胞或抑制细胞生长的活性。,3.抗病毒活性测定法 常用于检测抗病毒活性的细胞株有WISH,Hep2/c,L929,A549和MDBK等。其中WISH和Hep2/c细胞株用以检测人干扰素,L929细胞株用于检测小鼠干扰素,Ratec细胞株用于检测大鼠干扰素,而MDBK细胞株则可用于检测多种族的
9、IFN-和IFN-。 常用于攻击细胞的病毒有滤泡性口炎病毒(VSV)、鼠脑心肌炎病毒(EMCV)以及Sindbis virus等病毒。 检测抗病毒活性的方法:测定细胞因子抑制病毒的致细胞病变效应(CPE)、抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量等。,4.趋化活性测定法 多种细胞因子具有趋化活性，分别能诱导中性粒细胞、单核/巨噬细胞和淋巴细胞定向迁移 趋化因子诱导细胞移动的方式包括趋化性和化学增活现象。 趋化性(chemotaxis)是指诱导细胞向趋化因子化学浓度高的方向作定向移动,可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验测定细胞因子的趋化活性； 化学增活现象(chemokinesis)是指增强细胞的随机运动,
10、可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测。,(三)分子生物学测定法 RNA印迹法、核酸酶保护分析、原位杂交、PCR和Real Time PCR等。亦可通过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRNA量，推算出细胞因子的合成量。,(四)单个细胞产生细胞因子测定法 常用的方法有反向溶血空斑试验(RHPA)和反向ELISA斑点试验 (1)反向溶血空斑试验(RHPA):RHPA是一种体外检测抗体分泌细胞的试验,亦可用于检测细胞因子。 (2)酶联免疫斑点试验(ELISPOT):所用的包被抗体与酶标抗体应分别针对细胞因子的不同抗原决定簇,(五)细胞内细胞因子的检测 采用FCM免疫荧光技术可从单细胞水平检测不同细胞亚群
11、中的细胞因子,用两种标记的荧光抗体可在一种细胞内同时测定两种不同的细胞因子。,细胞因子受体检测的基本技术,细胞因子的广泛生物学活性是通过与各自相应的受体结合而发挥的。因此细胞因子受体的检测与细胞因子检测一样，已成为基础理论和临床免疫学研究的一个重要内容。,五、粘附分子的检测,某些粘附分子除表达于细胞膜表面外，还以可溶性形式存在于体液中。粘附分子的检测方法目前大多采用免疫学技术检查其在细胞膜上的分布和测定某些样品中的含量。,六、免疫相关基因分析,*包括各种类型的杂交技术，如转印杂交、斑点杂交、原位杂交等以及PCR技术等。 杂交技术主要工具是核酸探针，它是指一段用放射性核素或其他标记物(生物素、荧
12、光素、地高辛等)标记，并与目的基因互补的DNA片段或单链DNA、RNA。分为cDNA探针、寡核苷酸探针、基因组DNA探针及RNA探针等。 *核酸探针技术的操作主要包括：质粒DNA的提取；靶DNA片段的分离；靶DNA片段的标记；待测样品mRNA的提取；标记cDNA探针与待测样品进行杂交；放射自显影或显色分析。,(一)细胞因子基因组DNA或mRNA的检测 1. Northern杂交分析 2. 斑点杂交法 3. 原位杂交法 4. PCR扩增产物杂交分析 是将细胞因子的mRNA经过逆转录为cDNA，用特异性细胞因子引物进行PCR扩增，通过Southern blot后，再用标记探针检测特异细胞因子DNA
13、的水平。 5Southern印迹杂交 6. 斑点及狭缝印迹杂交: 将DNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上再进行杂交 7. 细胞因子mRNA表达的测定还可采用RT-PCR、原位杂交与原位PCR,RNA半寿期的检测,进行中的转录分析等。,(二)BCR及TCR克隆性基因重排分析 1Southern印迹杂交法：仅适用于科研，而不适用于临床诊断。 2. PCR扩增技术:正常多克隆淋巴细胞群DNA的扩增产物含有不同长度的片段，电泳检查呈现弥漫涂片状结构或多条带。而单克隆性基因重排经PCR扩增后，产生明显相同长度的片段，电泳呈现单一紧密折带状结构 *应用PCR 扩增技术进行基因诊断具有特异、敏感(1/1041
14、/105克隆性细胞)、快速(24h可完成)等优点。 *用于恶性淋巴瘤和白血病等的临床诊断以及白血病治疗后微小残留病灶的检测。,(三)HLA基因分型技术 1序列特异性寡核苷酸探针PCR(PCR-SSOP)或PCR-ASO:PCR-SSOP是目前应用最多的一种简单、快速而又精确的HLA-类抗原分型方法，能鉴定所有已知序列的HLA-DR、DQ、DP等位基因，精确地分析DNA的多态性。 2限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP)技术：此项技术特别适用于个别标本和小样本的检测。 3单链构象多态性PCR（PCR-SSCP）：藉此可鉴别编码HLA-类抗原基因的多态性。 应用PCR-SSCP可以直接比较供、
15、受体之间HLA-类基因是否完全一致，且可精确到12个碱基之差，具有相对简捷而精确的特点。在异基因骨髓移植的配型中已初步应用于临床。,4序列特异性引物PCR技术(PCR-SSP)：该法操作简单、快速、实验结果容易判断，杂合子也很易检出。不足之处在于，为检出所有的等位基因必须用多个引物进行扩增。 5指纹图谱 (PCR-fingerprinting)技术|：进行HLA-基因分型鉴定时，将供、受体的DNA扩增产物混合，电泳后得出一指纹图，再与二者各自的PCR指纹图谱进行比较，从中选择出指纹图一致的供、受体进行移植。 *PCR指纹图谱在选择非亲缘关系的供、受体进行骨髓和器官移植配型时，可以节省大量时间。
16、 6. SNP(单个核苷酸多态性)分析 (四)补体基因分析 (五)抗体基因分析 (六)细胞膜分子基因分析,七、免疫标记技术,(一)免疫荧光技术 (二)放射免疫分析法 (三)酶免疫技术 (四)发光免疫测定,八、免疫PCR(IM-PCR)技术,免疫PCR是将抗原抗体的特异性反应与PCR技术结合起来,用以检测微量蛋白质的方法。免疫PCR是用DNA分子标记特异性抗体，利用PCR可大量扩增DNA片段的特点，从而将检测灵敏度大大提高，最低检测值可达10-21mol/L。 1. 直接免疫PCR 是将抗原包被在固相载体上,用特异性单抗结合此抗原,再用生物素化抗体通过亲合素连接生物素化DNA,然后将后者进行PCR 2. 间接免疫PCR 系将所测物的单抗包被在固相载体上,然后使所测抗原与之结合,再将特异性抗体生物素化,并通过亲合素连结生物素化DNA分子而将后者进行PCR,九、新型抗体的制备技术,(一)对鼠源性抗体
