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1、第6单元 园林苗圃育苗新技术,主要内容,6.1 组织培养技术 6.2 容器育苗技术 6.3 无土栽培技术,学习目标,理论知识：植物组织培养、容器育苗及无土栽培的概念、特点、分类、发展特点及应用范围等。 一般技能：容器育苗中培养基质的原料来源和培养基质的配方、配制方法；无土栽培的条件和无土栽培技术。 关键技能：组织培养技术操作；容器育苗的播种技术。,6.1 组织培养技术,了解植物组织培养的概念、特点、分类、应用范围； 掌握植物组织培养的条件、组织培养技术。,组织培养概述,概念 是把植物的部分器官、组织、细胞以及原生质体等，在无菌和人工控制的条件下，接种到培养基上，使之形成完整植株的繁殖方法。 理
2、论基础 植物细胞全能性。 特点 分类 应用,植物组织培养的特点,优点 繁殖系数大。半年内可由一株苗木繁殖一百万株新个体。 解决常规育苗困难的问题。 培育脱毒苗。培养茎尖分生组织（0.20.3 mm）,可以脱掉病毒，育出无病毒苗（又称脱毒苗）。脱毒苗抗逆性强、质优、生长旺盛。 不受季节限制。一年四季均可进行，可实现工厂化育苗。 利于种质资源的保存。 缺点 需要一定的设备条件，技术要求较高，操作人员需要专门的培训。 试验阶段成本较高。,植物组织培养的分类,依据用做外植体的植物材料的不同来划分 植株培养 器官培养 胚胎培养 依据用做外植体的植物材料的不同来划分 组织培养 细胞培养 原生质体培养,依据
3、用做外植体的植物材料的不同来划分 组织培养 细胞培养 原生质体培养 依据所用的培养基不同来划分 固体培养 液体培养,植物组织培养的应用,无性系的快繁 对于不能用普通繁殖法或用普通繁殖法繁殖太慢的植物，如兰科植物、蕨类植物和许多观叶植物，组织培养技术是实现商品化生产的最佳途径。同时，对于新育成、新引进品种、稀缺品种、濒危植物和优良单株等可扩大繁殖。一个新育成品种问世后，可在两三年内迅速推广。 脱毒苗培育 利用植物茎尖上病毒分布少甚至没有的特点，进行培养、增殖。使用无病毒种苗，可以减少直至杜绝病毒病的传播。,植物组织培养的条件,植物组织培养的生产设施 实验室 主要仪器设备及器材 培养基 培养基的基
4、本组成 组织培养的培养基种类较多，但都包括无机营养、有机成分、碳素、琼脂、生长调节剂、水等。 MS培养基（Murashige和Skoog，1962年） 其他常用培养基 环境条件,实验室,准备室 用以进行组培时所需器具的洗涤、干燥、保存；蒸馏水的制备；培养基的配制、分装、包扎和高压消毒；处理大型植物材料，以及进行生理、生化的分析等各种操作。其要求与一般化学实验室相同。 接种室（无菌室） 要求室内干爽、安静，清洁明亮，保持良好的无菌和低密度有菌状态。主要用于培养材料的表面消毒、外植体的接种、无菌材料的继代转接等。 培养室 要求室内洁净、干燥。是进行初代、继代、生根培养的场所。,主要仪器设备及器材,
5、准备室的仪器设备与器材 天平 、酸度计、蒸馏水器冰箱 、烘箱 准备室的仪器设备与器材 高压灭菌锅、水槽 、实验台 、药品柜 、药品柜 、玻璃器皿 无菌室仪器设备与器材 超净工作台、双目实体解剖镜 、细菌过滤器、细菌滤膜 、接种工具,纯水机与蒸馏水发生器：,显微镜包括解剖镜，生物显微镜，倒置显微镜等。如茎尖的分离则需要解借助解剖镜。,酸度计：用于校正培养基和酶制剂的PH。,电炉,推车,酒精灯,封口膜,接种器具,灭菌器,培养瓶,培养室仪器设备与器材,空调 定时器 增湿机和除湿机 培养架 光照培养箱 摇床或旋转床 日光灯,培养基的基本组成,无机营养 大量元素 一般指浓度大于0.5 mmol/L，包括
6、C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等。它们是植物细胞中合成核酸、蛋白质、酶系、叶绿素等必不可少的营养元素。 微量元素 包括Fe、Cu、Mo、Na、Zn、Mn、B、Co等。它们在植物的生命活动中，多以辅基形式在酶系中起着重要的作用。在培养基中添加107105 mmol/L即可满足需要。,有机成分 维生素 主要有维生素B1(盐酸硫胺素)、维生素B3(烟酸)、维生素B6(盐酸吡哆素)、生物素、叶酸等。它们以辅酶的形式参与酶系的活动及细胞蛋白质、脂肪、糖代谢等重要的生理活动。 氨基酸 主要有甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺等。它们能促进不定芽、胚状体的分化。 肌醇 利于活性物质发挥作用并参
7、与糖代谢，能促进培养物快速生长。,植物生长调节剂 常用的主要有三大类：细胞分裂素类、生长素类、赤霉素类。对不定芽、胚状体、不定根等起重要作用。 细胞分裂素类 包括激动素（KT）、玉米素（ZT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）等。其作用强弱依次是ZTBAKT。具有促进细胞分裂、延缓组织衰老、诱导不定芽分化等作用。 生长素类 包括萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、2，4D等。其作用强弱依次是2，4DNAAIBAIAA。它们能促进不定根分化，低浓度2，4D有利于胚状体的分化。 赤霉素类 通常使用赤霉酸（GA3）。它能促进已分化芽的伸长，但不利于不定芽、不定根的分化。,糖 最好的
8、是蔗糖，其次是葡萄糖和果糖。是不可缺少的碳源和能源，还可维持一定的渗透压。愈伤组织与不定芽诱导最适的蔗糖浓度为3。 琼脂 从海藻中提取，主要组分为无取代的琼脂糖，其本身没有任何营养成分，遇热液化，在常温下固化，其无毒、无味、化学性质稳定，且可使培养基中各种可溶性物质均匀地扩散分布。一般用量为7，培养基偏酸时其用量酌情增加。加热时间过长，环境温度过高均会影响固化。 水 科研工作中宜选用蒸馏水或饮用纯净水。工厂化大量生产时，可就近选择水质软、清洁、无毒害的水源。,其他 天然生长促进物质 主要有麦芽提取液、酵母提取液、黄瓜汁、番茄汁、椰子汁、柑桔汁等。用于离体胚珠和胚培养。 活性炭 吸附非极性物质和
9、色素等大分子。通常使用浓度为0.510 g/L。对防止褐变有较为明显的效果。 防止褐变的添加剂 常用的防止褐变的氧化试剂有抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸及其盐酸盐等。,MS培养基的主要成分表（单位：mg/L）,环境条件,温度 通常培养物温度应控制在252范围内。 光照 在茎尖的起始培养及试管苗继代培养阶段光照强度为10003000lx，生根和小植株阶段以300010000lx为宜。每日光照时间1216h。通常用日光灯作为光源。 气体 培养物产生的乙烯、CO2、乙醇等气体会影响其生长和分化。采用能透气的封口膜为培养瓶封口，利于瓶内气体与外界的交换。,组织培养技术,培养基制备技术 准备工作 母液配制
10、 培养基配制 培养基保存 外植体获取与消毒 接种 培养 杂菌污染的识别及其预防 外植体的褐变及玻璃化现象,准备工作,玻璃器皿的洗涤是组培中很重要的准备工作。洗涤的质量对组培的结果有很大影响。清洗程序一般为：清水冲洗洗洁精水刷洗清水冲洗用蒸馏水冲12次晾干或烘干备用。洗涤后的玻璃器皿空置时间不要过长，最好不超过2周。,母液配制使用的主要仪器、器具,此外，还有药匙、玻璃棒、蒸馏水瓶等物品。,母液配制 MS培养基母液配制方法,将基本培养基按表配制成母液，放在冰箱中保存，用时按需要稀释。配母液用的水采用蒸馏水或去离子水。,MS培养基母液配制方法,生长调节剂母液配制,通常配成1mg/ml的母液，这样的浓
11、度即便于计算所需量，也可避免冷藏时结晶的析出。 生长素类母液 称取100mg吲哚乙酸（IAA）或吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）等，放入100ml的烧杯里，用数滴浓度为1molNaOH溶液使之溶解，加少量水，待完全溶解后倒入100ml容量瓶中，用水涮洗烧杯数次，涮洗液也倒入100ml容量瓶中，最后定容至刻度。反复摇动容量瓶，均匀后倒至棕色试剂瓶内，贴上标签存放在冰箱中。 细胞分裂素类母液 方法与其上大致相同，所不同之处为用0.11molHCl溶解，再加水定容。 赤霉素类母液 称取100mg赤霉素，用95%酒精溶解并加水定容至100ml。,MS培养基母液配制所用的仪器设备、器具,还有天平、烧
12、杯、滴瓶、电炉、玻璃棒、精密PH试纸。,6010便携式酸碱度计,MS培养基分装所用的仪器设备、器具,锥形瓶 分液漏斗架,灭菌器、搪瓷盘、手套,MS培养基灭菌所用的仪器设备、器具,不锈钢立式灭菌器,培养基配制,溶解琼脂和蔗糖 在1000ml的烧杯中加入600700ml纯净水，将称好的68g琼脂放进烧杯中加热煮溶后，加入30 g蔗糖，搅拌溶解。 加入母液 将母液、，按表中每配1 L培养基取母液所需量，分别加入到烧杯中，加水定容至1000ml。 调节pH值 搅拌后静止，用酸度计或pH精密试纸测定pH值，以1molNaOH或1molHCl将pH值调至5.8。 培养基封装 用漏斗将培养基分装到培养瓶中，
13、注入量约为瓶容积的1/4。分装动作要快。培养基冷却前应灌装完毕，且尽可能避免培养基粘在瓶壁上。,培养基配制,培养瓶封口 用塑料封口膜、塑料瓶盖等将瓶口封严。 培养基消毒 将包扎密封好的培养瓶放在高压蒸气灭菌锅中灭菌，在温度为121 ，压力107.9 kPa下维持1520 min。待压力自然下降到零时，开启放气阀，打开锅盖，取出后在干净柜中存放。灭菌时应注意在稳压前一定要将灭菌锅内的冷空气排除干净，否则达不到灭菌的效果。其次是灭菌的时间不宜过长，温度要严格控制在121 。过高的温度与过长的灭菌时间，会引起蔗糖降解，在磷酸盐的作用下，促使葡萄糖转化为酮糖及其他产物，磷酸盐与铁结合而沉淀，玻璃中的可
14、溶性物质释放到培养基中等。,培养基配制,植物生长调节剂等不耐热物质的过滤消毒 过滤消毒需在无菌室或超净工作台上进行。易受高温破坏的IAA、IBA、ZT、尿素、某些维生素等培养基组分可过滤消毒后加入高温高压消毒过的培养基中。过滤消毒可用细菌过滤器。防细菌滤膜孔径直径小于0.45m，溶液通过滤膜时，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。 在经高温高压灭菌的培养基中加入不耐热物质 在无菌场所进行。若为固体培养基，当其冷却至40 左右，琼脂将要凝结之前，加入经过滤消毒的各项不耐热成分，然后混匀放置，待冷凉备用。在培养瓶数量很大的情况下，这一操作往往很麻烦。若为液体培养基，可在冷却到室温后再立即加入。
15、,培养基保存,培养基从高压灭菌锅中取出后，应立即平放在平整的桌面或斜面架上，甚至培养基冷却凝固后再将它们转移。已经配制好的培养基最好经过3 d的预培养，防止灭菌不彻底的培养基在接种后被菌类污染而造成不必要的损失。 防尘 对于中小规模的生产者来说，通常将培养基存放于普通的房间里，此时要特别注意防尘工作，且在使用前要进行表面消毒。 避光 备用的培养基应贮藏于暗处，特别是在培养基中含有易于光解的吲哚乙酸等物质时更要注意。此外，在光照条件下，培养基的某些添加成分如椰乳会发生变化，不能达到预期的培养效果,恒温 当培养基冷却后，可于4左右的温度条件下贮藏36周。在贮藏过程中应避免环境温度大幅度的变化。因气
16、温骤升或骤降会使培养容器内的空气随之热胀冷缩，加大菌类进入培养基的机会。 定期更新 由于培养基的水分散失、某些培养基成分的光解变质的必然性，因此即使所贮存的培养基从外观上看不出什么变化，也必须定期更新，不宜长期贮藏。,外植体获取与消毒,从田间采回的准备接种用的材料称为外植体。对外植体进行表面消毒获得无菌材料，是组织培养成功与否的重要环节。 组织培养所选用的外植体，可为植物的茎尖、侧芽、叶片、叶柄、花瓣、花萼、胚轴、鳞茎、根茎、花粉粒、花药等器官。以快繁为主要目的时大多采用茎尖、侧芽等。一般情况下，生长期较幼嫩的材料茎尖、嫩叶、花蕾等部位更容易分化，培养效果较好。到田间取材时，一般应准备塑料袋、锋利的刀剪、标签、笔等。取材时间应选在晴天上午10时左右，阴雨天不宜。同时应尽量选择离开地表、老嫩适中的材料。要从健壮无病的植株上选取外植体。,从田间植株上采取的外植体比从温室植株采到的外植体更易受感染。如果我们必须从田间植株上采取外植体，最好先把这个植株种在室内的容器内，让其在室内发育新的嫩芽，然后用新发育成的嫩芽进行培养。在室内种植时，采用无土栽培，基质灌溉，保持3638
