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1、生物制药技术,蔡谨， 13857136417（676417） C 浙江大学玉泉校区教十5212室,Chapter 5 Gene Medicine (gene therapy),1.概念 基因：染色体上的DNA片段，是遗传信息结构和功能 的基本单位。 基因 决定 生老病死 控制 高矮胖瘦 影响 喜怒哀乐 基因组：某一生物的细胞中所带有的全部遗传信息。,一. 概述,基因与疾病 基因与人类的疾病密切相关： 遗传病是由于基因先天缺陷所致; 肿瘤的发生涉及多种基因改变, 包括癌基因激活或抑癌基因失活; 高血压, 糖尿病等多基因病也涉及到多种基因的改变; 由病原体所致的传染病也和人体基因密切相关, 存在易
2、感人群和耐受人群.,基因药物： 将具有治疗作用的基因重组进真核表达载体，直接转移到人体细胞，表达出具有治疗作用的蛋白质和多肽，从而达到治疗作用的新方法。 The application of genetic principles in the treatment of human disease By introduction of genetic material into target cells in order to counteract the effect of a disease gene or introduce a new function,“You may never ha
3、ve to purify a protein, or manufacture a drug, you just have to make the vector and get into the patient. Why bother marketing it? You can just let the cell do it.” Prof. Jum Wilsome, 美国基因治疗中心主任,基因治疗的必要条件,Understanding of the disease process Structure/function of gene to be introduced Efficient deli
4、very of gene control of gene expression Prevention/control of immune responses Animal model and assessment of function Clinical trial,研究基因治疗的三个基本步骤寻找适当的靶细胞导入目的基因基因表达,分类,生殖细胞基因治疗 （germline gene therapy） 生殖细胞或早期胚胎细胞 体细胞基因治疗(somatic-cell gene therapy) 体细胞,体细胞基因治疗始终需要考虑的问题基因转移的效率治疗的特异性基因表达的持久性及其调节治疗的毒副作
5、用 什么疾病什么基因什么载体什么靶器官和靶细胞什么基因导入方法,二、基因治疗和传统的基因工程的区别 二者都着眼于寻找可治病或有其他应用价值的“目的基因”。 基因工程： 目的基因载体导入大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞体外表达所需要的蛋白经过分离纯化获得能用于治疗或其他用途的蛋白纯品, 最终是制造出一种蛋白类的药物。,基因治疗目的基因载体导入人体，目的基因在人体内的细胞中制造所需要的蛋白达到治病的目的。 基因治疗在技术上一旦成功, 其优势： 制品为基因及其载体，非基因表达蛋白 产物,不需复杂的蛋白产物分离和纯化工艺 生产成本远远低于基因工程产品 从理论上讲,凡能治病的基因，都有可能开发 成为“药物”
6、 半衰期,但基因治疗难度高，技术要求极为苛刻。例如，针对各种疾病，必须具有能够达到治病目的的基因。在此基础上，还必须具有能有效地将基因导入人体的载体系统，这种系统要求高效，而且能定向地导入人体某种细胞。基因导入人体后，必须能够控制它的表达。,因此，基因治疗是生物高技术的高度集成，是遗传学、分子生物学、细胞生物学、分子病毒学等多种学科知识和技术的高度综合。,三、基因治疗的主要策略 Gene replacement Gene augmentation therapy (GAT) Gene correction (Chimeraplasty) Targeted killing of specific
7、 cells Targeted inhibition of gene expression (Gene ablation),Gene replacement: Deficient gene corrected by replacing the mutated allele with an intact allele; used for the treatment of autosomal dominant disorders. The strategies are as follows: a) kockout mutation by single crossing-over (insertio
8、nal inactivation) b) gene replacement by double (reciprocal) crossing-overc) target gene inhibition in dominant negative genetic disorders; usually mutated proteins which interact with normal cellular proteins to create altered properties; mutational inactivation of the one mutated copy will allevia
9、te this mutant phenotype ; the mutation can be carried out by insertional inactivation, or antisense technology.,Gene Augmentation Therapy (GAT) For diseases caused by loss of gene function more copies of normal gene raise levels of gene product restore normal phenotype Apply to: monogenic recessive
10、 diseases cystic fibrosis, haemophilia, muscular dystrophy,Gene Correction - Chimeraplasty,tumour cell,tk,thymidine kinase gene,viral vector,ganciclovir,ganciclovir phosphate,Targeted Killing Genetic Pro-drug Activation Therapy,Targeted inhibition of gene expression Ribozymes -can cleave (or repair)
11、 mRNA Triple helix oligonucleotides -block gene transcription Antisense oligos -block mRNA translation,All gene therapy strategies depend on getting the gene or genetic material into the target cells!,治疗方式 矫正性基因治疗 基因置换（gene replacement） 基因矫正 (gene correction) 基因增强 (gene augmentation) 调控性基因治疗 调控基因的表达
12、来达到改善疾病的目的 （1）反义技术 A） 反义基因到载体，耙细胞到反义RNA，封闭 mRNA的翻译 B) 合成反义寡聚脱氧核苷酸，化学修饰导入体内，胞吞与DNA结合形成核苷酸三聚体，与转录因子结合，转录不能启动；或与mRNA结合形成RNA-DNA杂链，影响基因的表达。,C）核酶 具有催化作用的RNA分子，能催化切割降解异常表达基因的RNA分子，已经设计出特殊的核酶。 （2）通过其他基因的代偿作用弥补缺陷基因的功能。,四. 基因转移体系,若干相关术语： Transfection 转染 ：过去：将病毒DNA或RNA 转入细胞。 现在：将外源DNA转入动物细胞。DNA Transfer 转移：基因
13、导入或转移广义的概念。Transduction 转导：噬菌体介导的细菌之间的基 因 转移。Transformation 转化：将裸DNA或质粒导入原核 和真核细胞。,转移途径,1） ex vivo 法，体外途径。 体外基因导入人体细胞，再将细胞植入人体。 经典，安全，效果较易控制，对基因转移效率 要 求不高，但步骤多，复杂，难度大。 2) in vivo法，体内途径。 将含治疗基因的重组载体直接植入体内。 操作简单，容易推广，但对基因转移技术要求高。,a,a,a,a,a,a,Ex-vivo,In-vivo topical delivery,In-vivo systemic delivery,E
14、xamples: - bone marrow - liver cells - skin cells,Examples: - brain - muscle - eye - joints - tumors,Examples: - Intravenous - intra-arterial - intra-peritoneal,THREE classes of anatomical gene delivery,基因治疗过程中的基因转移方法Viral vectorsNon-viral vectorsPhysical methods目前最有效的是病毒载体，但存在插入大小有限、免疫原性强和生产难等局限,1、
15、病毒载体类型 反转录病毒（RV）载体 retrovirus 腺病毒（AV）载体 adenovirus 腺相关病毒（AAV）载体 Adeno-associated virus 单纯疱疹病毒（HSV）载体 herpes simplex virus 慢病毒（lentivirus)载体等,对载体的基本要求： 特异并有效的基因转移 特异、高效、持续性表达，具有可控性 免疫原性低 易于生产,载体特征： reproducibility stable propagated purified to high titers mediated targeted delivery,基因治疗病毒载体比较 RV AV AAV HSV LV 基因组成 ssRNA dsDNA ssDNA dsDNA dsRNA 基因组长度 10kb 36kb 5kb 152kb 10kb 装载容量 8kb 8kb 4.5kb 30kb 9kb 病毒滴度 107 1011 108 108 108 感染细胞谱 窄 宽 宽 窄 宽 感染能力 中 很强 强 强 中 整合能力 有 无 有 无 强 毒性作用 遗传毒 细胞毒 遗传毒 细胞毒 遗传毒 免疫原性 弱 中等 弱 强 弱,病毒型载体,逆转录 病毒,腺病毒,疱疹病毒,腺相关 病毒,慢病毒,优点:安全，对人体低病原性针对增殖的细胞长期稳定表达
