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1、学 海 无 涯 1 附件 2 登革热实验室检测指南登革热实验室检测指南 一、目的一、目的 （一）及时发现、诊断病例。 （二）及时了解伊蚊媒介携带登革病毒状况。 （三）病毒分型和溯源。 （四） 为登革热流行趋势的预测、 预警和制定防治对策、 措施提供科学依据。 二、检测对象二、检测对象 （一）疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准 WS216-2008）。 （二）伊蚊成蚊和幼虫。 三、样本采集、保存和运输三、样本采集、保存和运输 （一）临床标本采集 用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血，及时分离血清，分装 2 份，保存于 带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中 1 份用于现场实验
2、室检测，1 份用于上级预防控制机构复核（附件 1，附表 1）。 1.登革热临床诊断病例及疑似病例，每次采集血液标本 5mL。 2.登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性），应采集双份血液标 本，入院当天和出院前 1 天各一份。 3.疫点首发病例，必要时应采集第二份血标本，距第一份血样采集日期间隔 在 7 天以上。 （二）蚊媒标本采集 疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定后，填写媒介标本采集信息表，按 照采集地点分装，每管 10-20 只。 （三）标本保存、运送 学 海 无 涯 2 标本应-70以下保存，血液标本可-20以下保存，但不超过 1 周。 标本运送时采用低温冷藏运输，避免冻融，
3、样本运输应遵守国家相关生物安 全规定。 四、检测内容四、检测内容 （一）实验室检测 登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清，检 测登革病毒抗原、核酸或抗体，检测流程参见图 1。 （二）复核检测 1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本，抽样 30%进行复核检测，疫点 首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测 不少于 5 例，疫情少于 5 例者应全部检测，病毒核酸阳性标本应分型检测。 2.疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用 PCR 方法进行分 型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增 E 蛋白编码基因， 完成序列分析
4、。 3.每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。 4.实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应对恢复期血清进行 IgM、IgG 抗体和/或中和抗体检测。 （三）媒介标本检测 1.核酸检测 捕获的伊蚊成蚊或幼虫，进行核酸分型检测，并扩增病毒 E 蛋白编码基因， 完成序列分析。 2.病毒分离 病毒核酸阳性的标本由国家、 省或有条件的市级疾病预防控制机构进行病毒 分离、基因组序列分析。 学 海 无 涯 3 图 1 登革热疑似病例实验室检测流程 五、实验室检测方法五、实验室检测方法 （一）临床标本检测 1、病原学检测 病原学检测主要适用于急性期血液标本。 （1）抗原检测：一般发病后 6 天内血液标本 N
5、S1 抗原检出率高。标本中检 出 NS1 抗原可以确诊病毒感染， 适用于现场快速检测， 可用于早期诊断 （附件 2， 3）。 学 海 无 涯 4 （2）核酸检测：一般发病后 6 天内血液标本病毒核酸检出率高。在病人血 清中检出病毒核酸，可确诊而且能够分型，可用于早期诊断，但核酸检测容易因 污染而产生假阳性，因此要求严格分区操作（附件 4）。 （3）病毒分离：一般发病后 5 天内血液标本病毒分离率较高。将标本接种 于蚊源细胞（C6/36）或哺乳动物细胞（BHK21、Vero）进行分离培养（附件 5）， 出现病变以后，用检测抗原或核酸的方法鉴定病毒。分离到登革病毒可以确诊， 但其耗时长，不适于快速
6、诊断。 2.血清学检测 血清学特异性抗体检测主要适用于发病 5 天以后血液样本， 但需注意可能与 其他黄病毒感染发生交叉反应。 （1）血清特异性 IgM 抗体：采用 ELISA、免疫层析等方法检测。IgM 抗体 阳性，提示患者可能新近感染登革病毒，适用于登革热早期诊断，但单份标本不 能确诊（附件 6）。 （2）血清特异性 IgG 抗体：采用 ELISA、免疫荧光（IFA）、免疫层析等 方法检测。患者恢复期血清 IgG 抗体阳转或滴度较急性期呈 4 倍及以上升高可 以确诊（附件 7，8）。 （3）中和抗体：采用空斑减少中和实验、微量中和实验等方法检测，可用 于分型。 患者恢复期血清中和抗体阳转或
7、滴度较急性期呈 4 倍及以上升高可以确 诊。 （二）媒介标本检测（二）媒介标本检测 1.标本处理 将分类后的伊蚊成蚊或幼虫，按照采集地点，每 1020 只为一份进行研磨 处理（附件 9）。 2.病毒核酸检测 用 RT-PCR 的方法进行登革病毒核酸检测（见附件 4）。 3.病毒分离 病毒核酸阳性的标本进行病毒分离（见附件 5）。 学 海 无 涯 5 六、实验室质量控制六、实验室质量控制 （一）标本采集、保存和运送 采集的标本要做好标识，并记录标本的基本信息和流行病学信息，按本指南 要求采集、保存和运送。 （二）实验室检测 1.根据发病时间，按本指南要求选择不同的检测方法。 2.核酸检测要防止各
8、种污染，按操作规范设立相应对照。 3.应对检测试剂开展质控评价。 （三）各级疾病预防控制机构应定期开展督导检查、实验室技术人员培训与 考核，及时发现问题。 七、结果的报告和反馈七、结果的报告和反馈 疫点首发病例、重症病例和输入病例实验室检测结果 24 小时内反馈标本送 检单位。 省级疾病防控机构应每年 1 月将上一年登革热实验室病原学（包括核酸检 测、病毒分离、序列测定）监测结果，报国家疾病预防控制中心（见附表 2）， 将结果发送至 。 八、生物安全八、生物安全 登革热实验室检测应按照病原微生物实验室生物安全管理条例等相关规 定要求，做好生物安全工作。 学 海 无 涯 6 附件： 1.血液标本
9、采集.血清分离.运送.保存标准化操作程序 2.酶联免疫法检测登革病毒 NS1 抗原标准操作程序 3.免疫层析法检测登革病毒 NS1 抗原标准操作程序 4.RT-PCR 法分型检测登革病毒核酸标准操作程序 5.细胞培养分离登革病毒 6.IgM 捕捉 ELISA 法（MacELISA）检测登革热 IgM 抗体 7.酶联免疫法检测登革病毒 IgG 抗体标准操作程序 8.免疫荧光法检测登革病毒 IgG 抗体标准操作程序 9.蚊媒标本处理标准操作程序 附表： 1.疑似登革热病人检材送检一览表 2.病原学检测结果一览表 学 海 无 涯 7 附件附件 1 血液标本采集、血清分离、运送、保存标准化操作程序血液
10、标本采集、血清分离、运送、保存标准化操作程序 1 目的目的 正确采集血液标本、分离血清、运送和保存。 2 范围范围 适用于有资质的人采集登革热患者或疑似患者血液标本、分离血清、编号、 分装、保存和运送。 3 操作步骤操作步骤 3.1 采血 3.1.1 用 70%酒精擦拭静脉穿刺部位待 30 秒钟以上。 3.1.2 然后用一根碘酊或碘伏棉签消毒皮肤（1-2%碘酊 30 秒或 10%碘伏消 毒 60 秒），从穿刺点向外以 1.5-2cm 直径画圈进行消毒。 3.1.3 用 70%酒精脱碘。 3.1.4 严格执行三步消毒后 (注意对碘过敏的患者，只能用 70%酒精消毒， 消毒 60 秒钟)， 待穿刺
11、部位酒精挥发干燥用无菌真空管， 采集患者非抗凝血 5mL。 3.2 分离血清 3.2.1 轻缓颠倒采血管数次，使血液与促凝剂混匀后静置，待血块完全凝固 （放置时间过长会造成溶血，避免留置过夜）。 3.2.23000rpm 离心，5 分钟，然后用无菌吸管小心取上清转入 3 支冻存管， 应避免吸取血细胞。 3.2.3 标记。用标签纸或持久性标记笔在冻存管的侧壁标记标本编号，顶端 标记序列号，标记清楚后将血清放进标本盒，保存于 2-8冰箱待初筛检测或运 送保存。在编码规则为“地区拼音首字母（JH）年份（2 位）月（2 位）-序列号 （3 位）”，如景洪市 2013 年 8 月份采集的第 12 份血标
12、本的血清编号为 JH1308-012，冻存管顶端分别标记 012-1，012-2 和 012-3。 3.3 运送保存。 3.3.1 如果 24 小时能够完成初筛检测，并将标本运送至上级单位，运送前应 将标本保存于 2-8冰箱，运送时采用低温冷藏运输。 学 海 无 涯 8 3.3.2 如果不能及时运送，运送前应将标本保存于-20冰箱，运送时采用干 冰或低温冷藏运输。 3.3.3 样本长期保存应记录剩余血清量和盒中位置，保存于-70以下冰箱。 3.3.4 所有样本运输和保存应遵守国家相关生物安全规定。 4 注意事项注意事项 4.1 使用后的注射器和针头应放置于耐扎的容器中，最后集中高压消毒，在 任
13、何情况下均不应试图将针头重新盖帽。 4.2 采血结束后脱掉手套并弃于耐高压的废弃袋中，以备集中高压灭菌，并 立即用肥皂和水洗手。 4.3 若发生针刺、皮肤破损或其它损伤，应立即用肥皂和水清洗伤口，不要 立即止血。 4.4 当血液污染了身体的任何地方或发生针刺等事故时，均应及时报告上级 并按医疗救护规程进行评估和救护。 学 海 无 涯 9 附件附件 2 酶联免疫法检测登革病毒酶联免疫法检测登革病毒 NS1 抗原标准操作程序抗原标准操作程序 1 目的目的 酶联免疫法检测患者血清中登革病毒 NS1 抗原。 2 适用范围适用范围 适用于患者血清或血浆中登革热病毒 NS1 抗原的快速检测。 3 实验前准
14、备实验前准备 3.1 核对被检样品（血清或血浆）患者的姓名、编号及检测项目等。 3.2 检测前应将待测样品置于 2-8冰箱或冰上。 4 检测项目及参数检测项目及参数 本方法检测项目为检测血清或血浆中登革热病毒抗原。 5 检测仪器设备和材料检测仪器设备和材料 加样器、温箱、洗板机、含波长 450nm 的酶标仪、登革病毒抗原检测试剂 盒（酶联免疫法） （万泰公司） 6 检测的环境条件检测的环境条件 生物安全二级实验室（BSL-2）中进行,灭活后样本在生物安全一级实验室 （BSL-1）内进行。 7 操作步骤操作步骤 7.1 将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡 30 分钟，使用前将试剂轻轻震 荡混匀。
15、 7.2 配液：将试剂盒中浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释。 7.3 编号：将样品对应微孔板编号，每板设阴性对照 3 孔，阳性对照 2 孔和 空白对照 1 孔。 7.4 加稀释液：每孔加稀释液 50L，空白孔除外。 7.5 加样：分别在相应孔加入待测样品或阴阳性对照各 50L，空白孔除外。 7.6 温育：用封板膜封板后，置 37温育 60 分钟。 7.7 每孔加酶标试剂 50L，空白孔除外，轻轻震荡混匀。 7.8 温育：用封板膜封板后，置 37温育 30 分钟。 学 海 无 涯 10 7.9 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤 5 遍，最后一次尽量扣干。 7.10 显色：每孔加入显色剂 A、B
16、 液各 50L，轻轻震荡混匀，37避光显 色 15 分钟。 7.11 测定：每孔加终止液 50L，10 分钟内测定结果。设定酶标仪波长于 450nm 处（建议使用双波长 450nm/600-650nm 检测） ，用空白孔调零后测定各孔 A 值。 8 结果判定结果判定 8.1 临界值计算： 临界值=0.10+阴性对照孔 A 值均值 （阴性对照孔 A 值低于 0.05 者以 0.05 计算） 。 8.2 阴性对照的正常值范围： 阴性对照孔 A0.1 （若 1 孔 A 大于 0.1 应舍弃， 若两孔或两孔以上阴性对照大于 0.1，应重复实验） 。 8.3 阳性对照正常值范围：A0.8. 8.4 阳性判定：样品 A 值临界值者为登革病毒抗原阳性。 8.5 阴
