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1、学 海 无 涯 1 实验二 总 RNA 的提取和检测 实验目的 1.掌握从动物组织细胞中提取总 RNA 的方法； 2.熟悉紫外吸收法检测 RNA 浓度与纯度的原理及测定方法； 3.掌握 RNA 琼脂糖凝胶电泳方法并分析总 RNA 的电泳图谱； 实验原理 （一）概述 1. 10-5 g RNA/细胞含有 rRNA 80-85%：28S 18S 5S tRNA, snRNA 10-15% mRNA 1-5% 2. mRNA 3端存在 20-250 个多聚腺苷酸(polyA) 结构， 可用 oligo(dT)亲和层析柱 分离 mRNA。 3.RNA 分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有
2、机溶剂法，氯化 锂-尿素法，蛋白酶 K-细胞质 RNA 提取法、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。 4.目前常用的是 Trizol 法。 （二）Trizol 的主要成分 1.Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂，主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。异硫氰 酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂 解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。 2.酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制 RNA 酶活性，因此 Trizol 中 还加入了 8-羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase。 3.溶解组织细胞的混合物在氯仿作用下溶液分为水相和有机相，RNA 在上层
3、水 相中。 4.取出水相用异丙醇沉淀可回收 RNA；用乙醇沉淀中间层可回收 DNA。 (三)总 RNA 的纯度检测原理： 不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收， 光能量被 吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。RNA 在 260nm 紫外光波长处有最大 的吸收峰。 因此， 可以用 260nm 波长分光测定 RNA 浓度， OD 值为 1 相当于大约 40g/mL 学 海 无 涯 2 的单链 RNA。用 PH=7.6 的 TE（tris HCl 缓冲液）稀释 RNA 样品 n 倍并以 TE 为 空白对照，根据此时读出的 OD 260 值即可计算出样品稀释前的浓度: RNA
4、(mg/mL) = 40OD 260 读数稀释倍数(n)/1000 实验步骤 （一）样品处理与 Trizol 用量 1.提取组织 RNA 时，每 50100mg 组织（即 0.50.50.5cm,约合 0.1cm3）用 1ml Trizol 试剂对组织进行裂解； 2.悬浮细胞先离心沉淀，每 5-10106 个细胞加 1mL Trizol 后，反复用枪吹打或 剧烈振荡以裂解细胞。 3.培养贴壁细胞不须消化，可直接用 Trizol 进行消化、裂解，Trizol 体积按 10cm2/mL 比例加入。(注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量 RNA 的前提；细 胞数量与 Trizol 的比例，细胞的数量不
5、能过多。) （二）操作步骤 1.细胞中加入 1 mLTrizol 用移液枪反复吹吸直无明显沉淀后，室温放置 5min，使 其充分裂解。 （注意：此时可放入-70长期保持） 2.按 200 L 氯仿/mL Trizol 加入氯仿，振荡混匀后室温放置 2-3min。(注意：此 步一定要振荡混匀，使氯仿和 Trizol 不分层) 3. 412,000g 离心 5-10min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上 层为无色水相和一个中间层。RNA 主要在水相中，水相体积约为所用 Trizol 试 剂的 60。 4.吸取上层水相，至另一新的离心管中。一般 400-450L 就足够了，千万不要 贪
6、多！ （注：千万不要吸取中间界面） 5.加入与水相等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，4放置 5 min。 7.412,000g 离心 10 min，弃上清，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 8.加入 1 mL 75%乙醇， （在沉淀对面管壁加入，切勿触及沉淀！ ）盖紧盖子后， 温和转离心管 1 周，充分润洗管壁。 9.412,000g 离心 5 min，尽量弃上清。 10.室温晾干或真空干燥 5 min。 （注：RNA 样品不要过于干燥，否则很难溶解） 11.加入适量冰冷无 RNase 的 PEPC 水（一般 10 -20L） ，充分震荡混匀，瞬时 学 海 无 涯 3 离心，备用。 （三）检测步骤 1.将提取的 RNA，按 1：20 加入 TE 进行稀释 2.稀释过后用分光光度仪进行检测，先使用 TE 行进校对，空白对照，所有样品 要先润洗三次之后，再加入 50L 样液进行检测 3.可直接显示 260nm 下的 OD 值以及，260/280 的对比结果 4.再将剩余未稀释的 RNA 提取液，进行琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的完整性 （具体琼脂糖凝胶电泳操作步骤见实验三） 结果与分析
