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1、项目名称：动脉粥样硬化发病机制及其诊治与干预的基础研究首席科学家：刘德培 中国医学科学院基础医学研究所起止年限：2011.1至2015.8依托部门：卫生部二、预期目标总体目标：本项目旨在从我国AS人群特有的遗传背景及分析致病的内外环境危险因素为切入点，结合系统生物医学观念和手段,针对在AS发生中起重要作用的内外环境中有利和不利因素，阐述AS发生、发展和转归的规律,揭示血管重塑和AS斑块不稳定的机理,结合临床研究为制定适合我国国情的针对AS及其并发症的早期预警和早期干预策略及防治方案提供新的思路和科学依据，积极推进临床转化。五年预期目标：阐明能量限制和特殊饮食，脂质代谢紊乱和含硫氨基酸家族等因素
2、影响AS发病的细胞分子机制；初步阐明血管重塑和动脉粥样硬化斑块不稳定的影响因素及分子机制。寻找出1-2个可用于AS新的早期预警分子，并建立其检测方法和预警指标确定35种新的抗AS靶点分子，明确其功能及临床意义。培养博士生80名，硕士生60名。培养优秀中青年人才，产生杰出青年与,建设一支优秀的转化医学研究人才梯队。申请一批发明专利，促进开发有自主知识产权的成果转化。本项目实施中取得的基础性研究成果将在国际刊物上发表影响因子（IF）5.0有代表性学术论文60篇，其中IF10的论文15篇，顶级杂志论文2-5篇。三、研究方案本课题项目分为六个部分，第一部分开展中国人群AS疾病分子遗传基础;第二部分紧密
3、联系内外环境因素中限制能量饮食和特殊饮食，研究有利和不利因素和机体相互作用在AS发病中的机制;第三部分阐明脂代谢紊乱，尤其是TG和HDL代谢紊乱导致AS的分子机制;第四部分阐述含硫氨基酸家族特别是Hcy与 H2S在AS发生和发展中炎症和免疫作用及其分子机制；第五部分针对血管重塑是AS管腔狭窄的关键因素，研究影响血管重塑的因素和作用的分子机制；第六部分针对AS斑块不稳定及早期防治，研究斑块从不稳定向稳定的方向转变的分子机制和干预策略。这六个部分结合系统生物医学观念和手段，从临床提出科学问题，围绕着AS的发生发展和转归的分子调控机制和早期干预这个科学核心进行研究，寻找AS早期预警分子，并建立其检测
4、方法和预警指标,确定抗AS新靶点分子,探讨防治AS的有效方法和降低心脑血管疾病发病率和死亡率的途径。动脉粥样硬化发病机制及其诊治与干预的基础研究 第一部分 中国人动脉粥样硬化遗传分子基础学术思路与技术途径：1.结合中国人群心肌梗死GWAS和国外人群的研究结果，同时选择炎症、脂代谢以及血压调控通路相关基因，在10000例急性冠脉综合征病例对照样本中筛查AS新的基因和遗传变异。2.采用临床技术手段测定颈动脉内膜中膜厚度、脉搏波速度等AS亚临床表型和多种生物标记物，综合评价遗传因素与AS发生/发展、以及斑块稳定性的关系。3.探讨重要多态对易感基因转录活性的调控作用，寻找与多态可能结合的转录因子，进而
5、研究多态对易感基因所在信号通路的调控作用及细胞生理活性改变。应用microRNA技术，确定斑块发生发展过程中炎症反应系统表达谱，研究炎症在冠状AS斑块发生发展过程中的作用及机制；并利用动物模型寻找冠状AS疾病新的遗传易感基因。4.对2000例社区高危人群进行前瞻性随访，动态监测AS相关生理指标的变化和AS的进展情况。评价遗传位点及其联合作用与AS指标间的关系，计算人群归因危险度，构建遗传因素及环境危险因素的预测模型。亚临床指标：颈动脉IMT、PWV等SNPs、CNVs及单体型血脂代谢、炎症反应、血压相关通路基因AS斑块钙化及稳定性评价确定遗传变异位点中国人群GWAS研究数据的深入挖掘人体测量、
6、血脂、生物标记物检测2000例社区高危人群10000病例对照人群验证欧美人群GWAS报道的AS相关位点高危人群随访，构建预测模型功能研究揭示遗传分子机制研究特色与创新：结合中国人群GWAS研究中200万个遗传变异信息以及多个代谢通路基因网络，基于通路和遗传网络系统分析SNPs、CNVs和单体型变异信息，采用CART、MARS、MDR、贝叶斯网络、随机森林等数学模型，构建遗传因素及环境危险因素的预测模型，找到检查、定量临床疾病亚型的干预靶点，监测疾病进展，确定高危患者，最终实现定量风险评估和个性化早期预警。可行性分析：目前收集了高质量的20000例冠状动脉综合征、冠心病和心肌梗死的病例对照资料，
7、为开展大规模重复验证奠定了基础。完成了30余个基因与冠心病和脑卒中的关联和功能研究，发现了数个在国人冠心病和脑卒中发病中具有重要作用的SNPs及单体型。已经应用Affymetrix 500K芯片完成了1500例心梗病例对照的全基因组关联研究，在此基础上进行了imputation，获得200万个遗传变异信息，并发现一系列显著关联位点和区域。应用CART和MARS模型开展了相关代谢通路中11个候选基因的33个SNPs的多基因统计分析，发现SNPs位点间的交互作用在高血压发生中具有重要作用（Hypertension 2006，47：1147-54）。在易感基因功能研究方面，具备分子生物学、真核基因表
8、达调控的研究梯队，并已开始进行心血管疾病易感基因/多态的功能研究。第二部分 内外环境因素影响动脉粥样硬化发生发展的分子机制学术思路与技术途径：1.首先构建AS的诱导模型，引进ApoE-/-鼠或LDLR -/-鼠并给与高脂饮食饲养诱导AS模型。给与辣椒素及黄酮类物质喂食，分离动脉，油红O染色观察斑块面积大小。观察对于斑块形成和面积大小是否有影响。转录组学发现辣椒素和黄酮类物质影响AS发生发展过程相关的信号途径和分子。对于能量限制，由于小鼠体内致AS必需要高脂饮食，无法直接观察能量限制对于AS的影响，因此我们在体内和细胞水平进行能量限制，通过转录组学发现能量限制影响到的基因，对该基因进行深入研究。
9、2.对找到的分子，进行体内和体外实验阐明其功能。在细胞水平，我们通过过表达，干扰以及分子的激活剂和抑制剂处理观察对于不同细胞功能的影响，如对内皮细胞的衰老，对平滑肌细胞的增殖和迁移，对巨噬细胞的吞噬功能的影响；在动物水平，我们构建转基因和基因敲除动物，并与ApoE-/-鼠杂交，同时给予高脂饮食，最后观察对于斑块的形成及面积大小有无影响。3.对于这些分子的起作用的机制，我们利用蛋白质相互作用的技术方法找到这些分子的相互作用蛋白，阐明信号通路；并通过基因表达调控的方法和技术，阐明对于下游基因表达和调控的影响。通过明确信号通路和下游基因构建小范围的相互作用图谱。4对于研究中发现起作用的关键分子，探讨
10、其作为诊防治靶点的可能性。获取临床标本，观察AS发病与关键分子的RNA、蛋白表达水平是否存在相关性；分析关键分子的激活剂或抑制剂是否抑制或促进AS的发生发展。明确该分子是否可作为AS诊防治的靶点。血管功能与AS斑块分析转基因/基因敲除等动物实验过表达或干扰等分子生物学技术信号通路与细胞功能变化提供诊、防、治靶点与措施基因表达谱改变，蛋白质组学变化AS关键调控分子构建分子作用小网络组蛋白修饰，DNA甲基化等表观遗传学变化能量限制及辣椒素，黄酮等类物质的特殊饮食研究特色与创新：1.本研究从能量限制这个新视角探讨AS的发病机制，具有很强的原创性和新颖性。2.提出辣椒素等特殊饮食对于AS发病的影响。将
11、外源性环境因素与其内源性作用靶点联系起来，探讨动脉粥样发病的分子机制。可行性分析：课题组长期从事AS的研究，对于内外环境因素影响AS的发病及其机制的研究具有较好的实验基础。前期已系统研究了一些特殊饮食的作用及靶点和能量限制的相关分子，建立了各种血管细胞的原代培养模型和多种检测细胞功能的方法；拥有成熟的分析基因表达调控和信号传导以及表观遗传调控的分子生物学方法。有转基因动物构建技术和平台，并有辣椒素靶点TRPV1敲除鼠及能量限制相关分子Sirtuins基因家族的转基因动物、组织特异性转基因动物和基因敲除动物。第三部分 脂代谢紊乱导致动脉粥样硬化发病的分子机制学术思路与技术途径：体外研究：1.原代
12、培养血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞，与不同类型富含TG脂蛋白以及II型糖尿病患者HDL共培养，用氧化应激和炎症通路相关因子矩阵PCR和蛋白组学方法，确认特异性的氧化应激途径；明确促进内皮环氧合酶2（COX2）活性和表达的分子机制；2.应用RNA干扰、特异性抗体和特异性激动和阻断剂，对脂质沉积、细胞活化、增殖和凋亡等AS病变以及COX2表达等细胞生物学终点进行干预分析；3.免疫共沉淀法确认与清道夫受体A（SR-A）胞浆域特异结合的分子，并通过筛选噬菌体肽库钓取与胞浆区特异性结合的多肽，进一步对这些分子和多肽进行抗AS功能分析。体内研究：1.制备AS易感的高TG小鼠模型，喂饲高脂食物以及损伤其
13、动脉壁加速AS形成，检测动脉、心脏和肝脏的基因组、蛋白组和代谢组学的改变，并分析这些组织的氧化应激、炎症以及脂代谢通路中相应的改变，并用其他动物模型进一步验证。2.在此基础上选择数个干预靶点进行实验性治疗。同时寻找对高TG所致AS有预测性的生物标识物，并在相应的临床病人中进行验证。3.制备干扰SR-A胞浆结合域功能的转基因小鼠模型，以验证在体内是否能够减缓AS的形成。并应用从多肽库筛选得到的干扰SR-A胞浆结合域的多肽进行实验性治疗，为临床防治AS提供新的措施。血管壁、心脏和肝脏的基因组、蛋白组及代谢组学分析氧化应激和炎症通路矩阵PCR和蛋白组学确认靶分子；结合分子对体外实验确认的靶点实验性治
14、疗RNAi、抗体、抑制剂拮抗验证激活、增值、脂质沉积、COX2表达；SR-A胞浆域结合分子原代血管内皮、平滑肌、巨噬细胞，表达SR-A的293细胞高脂食物诱导和动脉壁球囊损伤（体内研究方案富含TG脂蛋白、II型糖尿病患者HDLAS易感的ApoCIII转基因和LPL缺陷高TG动物模型不同类型的AS病变形成，心、肝其它器官的血管病变体外研究方案 对比 分析 阐明高TG导致AS的新通路确定新的抗AS靶点提出早期干预AS的新措施研究创新性：高甘油三酯血症可通过氧化应激导致AS形成；证明清道夫受体A的胞浆域在AS发生中起关键作用；发现HDL具有调节内皮细胞环氧化酶1的新功能。应用系统生物学手段对这些新发
15、现进行从分子、细胞到整体水平进行深入探索，从而提出新的假说和理论。可行性分析：围绕本课题的设置，已经建立了多项实验技术，并取得了较多相关的预实验结果，包括：1)发现了富含TG脂蛋白携带大量的脂质过氧化产物，并通过氧化应激反应引起内皮细胞的活化，有可能成为AS形成的始动因素；2)通过对巨噬细胞中的清道夫受体SRA1胞浆域的相互作用研究，发现了具有结合胞浆域功能并干扰氧化LDL内吞作用的基因GRP78。据此合成的多肽H11可以减少巨噬细胞中脂质的沉积。3)通过对化合物库的筛选，发现了一种化合物GYY4137可显著减少ApoE基因敲除小鼠的AS面积，并改善主动脉舒张功能；对血浆胆固醇和HDL没有影响却可降低TG水平。4)糖尿病患者的HDL能显著增加内皮细胞
