第四章兽医生物制品监察制度与质量检验课件

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1、第四章 兽医生物制品 监察制度和质量检验,兽医生物制品生产实施监察制度的意义，及其包含的主要内容。 兽医生物制品质量检验的项目，其中三大检验项目的内容、方法及其要点。,目标,第一节 兽医生物制品的监察制度 第二节 兽医生物制品的质量检验,内容,一、兽医生物制品质量管理体系 二、菌毒虫种和标准品的管理 三、防止散毒的原则与措施 四、制品的贮存及运输 五、新制品的管理 六、进口制品的管理,第一节 兽医生物制品监察制度,兽药管理条例 兽药生产许可证 , 营业执照 , 批准文号 监察室 ，中监所 兽用新生物制品管理办法 进口兽药登记许可证 兽药生产质量管理规范,北京中关村南大街8号,用于兽医生物制品制

2、造和检验用的菌种、毒种等均实行种子批和分级管理制度。,种子分三级： 原种：由研究单位和中监所负责保管； 基础种子：由中监所或中监所委托的单位负责制备、鉴定、保管和供应； 生产种子：由生产企业自行制备，按各项规程的规定鉴定后使用。,新制品是指我国创制或首次生产用于畜禽等动物疾病预防、治疗和诊断用的生物制品；对已批准的生物制品所使用的菌毒种和生产工艺有根本改进的，亦属于新制品管理范畴。,第一类：我国创造的制品；国外仅有报道而未批准生产的 制品。 第二类：国外已批准生产，但我国尚未生产的制品。 第三类：对我国已批准的生物制品使用的菌毒种和生产工 艺有根本改进的制品。,第二节 兽医生物制品的质量检验,

3、一、无菌检验或纯粹检验 二、安全检验 三、效力检验 四、其它检验项目,一、无菌检验或纯粹检验（test or purity test）,除特殊规定外，兽医生物制品都不应有外源微生物污染。灭活菌苗、疫苗不得含有活的本菌、本毒。,各类兽医生物制品必须在无菌条件下进行无菌检验或纯粹检验。,（一）检测样品的采集 应随机取样，样品应有确切的代表性。,1.制造疫苗用的各种原菌液、毒液和其它配苗组织乳剂、稳定剂及半成品的无菌或纯粹检验，应每瓶（罐）分别抽样进行，抽样量为210mL。 2.成品的无菌或纯粹检验应按每批或每个亚批进行，每批按瓶数百分之一抽样，但不应少于5瓶，最多不超过10瓶，分别进行检验。,（二

4、）检验用培养基 1.无菌检验 厌氧性及需氧性细菌的检验用硫乙醇酸盐培养基（T.G）及酪胨琼脂培养基（G.A）。 霉菌及腐生菌检验用葡萄糖蛋白胨水（G.P）。 2.活菌纯粹检验用适于本菌生长的培养基。 3.灭活检验用适于本菌生长的培养基。,（三） 兽医生物制品的无菌检验及纯粹检验 1.细菌活菌苗半成品：取样接种于T.G小管以及适宜本菌生长的其他培养基斜面各2支，每支0.2mL，1支置37培养，1支置25培养，均观察35d，结果应纯粹。 2.病毒活疫苗半成品：取样接种于T.G小管和G.A斜面各2支，每支0.2mL，1支置37培养，1支置25培养，观察35d，结果均应无菌生长。 3.细菌灭活菌苗：各

5、取样0.2mL分别接种于2支适宜本菌生长的培养基，置37培养5d，结果应无菌生长。 4.含防腐剂和抗生素的制品：取样品1 mL接种于50 mlLT.G培养基小瓶中，置37培养，3d后自小瓶中吸取培养物，分别接种T.G小管及G.A斜面各2支，每支0.2mL，T.G小管置37培养，G.A斜面置25培养。另取0.2mL接种1支G.P 小管，置25培养。均培养5d，结果应无菌生长。 5.细菌性活疫苗：将样品直接接种T.G小管、G.A斜面或适于本菌生长的其他培养基各2支，每支0.2mL，1支置37培养，1支置25培养。另取0.2mL接种1支G.P 小管，置25培养。均培养5d。结果应纯粹。,注：如制品允

6、许含有一定数量的非病原菌，则应进一步作杂菌计数和病原性鉴定。,二、安全检验（innocuity test）,安全性是兽医生物制品最重要的条件，各种制品都必须安检合格方可出厂。,（一）安全检验的内容,1.检验外源性污染：细菌、病毒、支原体 2.检查杀菌、灭菌或脱毒情况 3.检查残余毒力或毒性物质 4.检查对胚胎的毒性,（二）安全检验的方法及要点,1.方法：动物检验。 2.动物： 应为普通级或清洁级，有些制品要使用SPF级。 凡能以小动物做出正确判断者则用实验小动物。禽苗可直接以使用对象动物作安检。 无论何种动物，均要选用敏感性高的一定年龄、体重的规定品种、品系的动物。 除了动物的敏感性以外，动物

7、的健康状况也与安检结果的正确判断密切相关。 试验期间的饲养管理也会影响安检结果的判断。 3.剂量：安检剂量通常应高于免疫剂量5-10倍以上。 4.外源性病原体检查,（三）安全检查的判断,1.安检期死亡的动物经解剖明确非制品所致者可以重检，如检验结果可疑难以判定时，应以加倍头数的该种动物重检。 2.凡规定用多种动物进行安检的制品，均应安全合格。 3.用小动物检验不合格者，有的规定可用使用对象动物重检。但使用对象动物检验不合格者，不能再以小动物重检。,三、效力检验（potency test）,兽医生物制品的效力是指它的使用价值。,（一）效力检验的内容,1.免疫原性 2.免疫产生期与免疫持续期 3.

8、抗原的热稳定性 4.抗原量的测定 即最小免疫量:半数保护量（PD50）/半数免疫量（ImD50）,（二）效力检验的方法和要点,1.动物保护力试验 定量免疫定量强毒攻击法； 定量免疫变量强毒攻击法 ； 变量免疫定量强毒攻击法 ； 被动免疫抗体测定 2.活菌计数与病毒量的滴定 活菌计数; 病毒量的滴定 3.血清学方法 凝集试验； 沉淀试验； 中和试验； 补体结合试验； 抗毒素单位测定; 类毒素单位的测定, 定量免疫定量强毒攻击法 以被检品接种动物，经2-3周后，连同对照动物用相应的强毒攻击，观察动物接种后所建立的自动免疫抗感染水平，即以动物的存活或不受感染的情况来判定制品的效力。,定量免疫变量强毒

9、攻击法 把动物分为两大组，一为免疫组，一为对照组，两大组又各分为相等的若干小组，每小组的动物数相等。免疫动物均用同一剂量的制品接种免疫，经一定时间后，与对照组同时用不同稀释倍数强毒攻击，比较免疫组与对照组的存活率。,变量免疫定量强毒攻击法 将疫苗稀释为各种不同的免疫剂量并以之接种动物，间隔一定时间待动物的免疫力建立以后，各免疫组连同对照组均用同一剂量的强毒攻击，观察一定时间，用统计学方法计算能使50%的动物得到保护的免疫剂量（PD50）。,被动免疫抗体测定 用经高度免疫的动物抗病血清注射易感动物，经一定时间（一般1-3d）用相应的强毒攻击，观察血清抗体被动免疫所引起的保护作用，各种抗病血清的检

10、验均用此法。,四、其它检验项目,（一）物理性状检验 （二）干燥制品剩余水分检验 （三）真空度测定 （四）其他（甲醛与硫柳汞含量的测定等）,（一）物理性状检验,1.液体疫苗和诊断液：外观必须符合其规定要求，同时检查瓶装量是否准确、封口是否严密及瓶签有无差错等。 2.冻干疫苗：应为海绵状疏松物，色微白、微黄或微红，无异物和干缩现象。加稀释液或水稀释振荡后，在常温下应在5min内迅速溶解呈均匀一致的悬浮液。 3.血清制品：应为微带乳光橙黄色或茶色清朗液体，不应有摇不散的絮状沉淀与异物。若有沉淀时，稍加摇动，即成轻度均匀混浊。装量、封口、瓶签同时检查。,油乳剂灭活疫苗的物理性状检验： 视检：应呈乳白色

11、，颗粒均匀的混悬液，无沉淀，无凝块，无其它异物。 粘度测定：适于测油乳剂苗用的是流出法，用Saybolt粘度计。但最简易的方法是取内口直径为1.2mm的1mL吸管，在室温下吸满1mL乳剂，垂直放出0.4mL所需时间作为粘度单位，以0.4mL2-6s为合格，不得多于10-15s，否则注射时就比较困难。 乳剂稳定性测定 加速老化法：疫苗于37贮存10-30d不破乳。 离心加速分层法：在一个半径为10cm的离心器中装油乳剂，3000r/min离心15min不分层，相当于保存1a以上不破乳。 乳剂类型的测定 Robertson的染料法：用“Sudan油溶性染料”和“亮蓝FCF”水溶性染料，分别加入两份

12、乳剂中，轻轻摇动，若是整个乳剂染油溶性染料即外相为油（W/O），若整个乳剂染水溶性染料即外相为水（O/W）。 冲淡或滴于冷水表面：此法是根据乳状液搀合的物质（油或水）来确定外相的性质。 电导法：因为多数的油皆是不良导体，而水则是良导体，用万能电表把两极分开插入乳剂中，能导电者外相为水，为水包油乳剂；不能导电者外相为油，为油包水乳剂。 粒度大小及分布的测定：用显微镜直接观察，或用光散射法和透射法或微计测定之，以直径10um均匀颗粒的乳剂为较好。,（二）干燥制品剩余水分检验-真空烘干法,1.测定前，先将洗净干燥的称量瓶，置150干燥箱烘干2h，放入有无水氯化钙容器中冷却后称重。 2.迅速打开真空良

13、好的疫苗瓶，将制品倒入称量瓶内盖好，在天平上称重。 3.每批做4个样品，每个样品的重量为100-300mg，称后立即将称量瓶置于有五氧化二磷的真空干燥箱中，打开瓶盖，关闭真空干燥箱后，抽真空在2.67kPa（20mmHg）以下，加热至60-70，干燥3h。 4.通入经过氯化钙吸水的干燥空气，待真空干燥箱温度稍下降后，打开箱门，迅速盖好称量瓶的盖，取出所有称量瓶，移入有氯化钙干燥器中，冷却到室温后，称重量。 5.再移回真空干燥箱继续烘干1h，两次烘干达到恒重（恒重是指物品连续两次干燥后重量差异在0.5mg以下的重量），减失的重量即为含水量。 6.剩余水分计算公式为： 样品干前重样品干后重 含水量

14、100 样品干前重 7.冷冻真空干燥生物制品剩余水分均应不超过4.0。,注意事项： 1.快速 2.干燥环境中进行 3.所用工具必须干燥,快速、干燥。,（三）真空度测定,使用高频火花真空测定器对采用真空密封，并用玻璃容器盛装的冻干生物制品，在玻璃容器的外边放电进行检测。如果容器内出现白色、粉色和紫色辉光，则真空度为合格。注意放电火花不应指向容器内的制品部分，否则会损伤制品。,（四）甲醛含量的测定,1.对照品溶液的制备：取已标定的甲醛溶液适量，配成每1mL含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5mL于50mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。如被测样品为油乳剂疫苗，则精密量取上述每1mL含甲醛1.0mg的

15、溶液5mL于50mL量瓶中，加20吐温-80乙醇溶液10mL，再加水至刻度，摇匀，即得。 2.供试品溶液的制备 油乳剂疫苗：用5mL刻度吸管量取本品5mL，置50mL量瓶中，用20吐温-80乙醇溶液10mL，分次洗涤吸管，洗液并入50mL量瓶中，摇匀，加水稀释至刻度，强烈振摇，静止分层，下层液如不澄清，过滤，弃去初滤液，取澄清续滤液，即得。 其它疫苗：用5mL刻度吸管量取本品5mL，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，溶液如不澄清，过滤，弃去初滤液，取澄清续滤液，即得。 3.检验法：精密吸取对照品溶液和供试品溶液各0.5mL，分别加醋酸-醋酸铵缓冲液10.0mL，乙酰丙酮试液10.0mL，

16、置60恒温水浴15min，冷水冷却5min，放置20min后，照分光光度法，在410nm的波长处测定吸收度，计算，即得。 4.计算公式：,供试品溶液的吸收度 甲醛溶液（40）含量（g/mL）0.25 对照品溶液的吸收度,（四）硫柳汞含量的测定,1.对照品溶液的制备：精密称取于硫酸干燥器中干燥至恒重的二氯化汞0.1354g，置100 mL量瓶中，加硫酸液（0.5mol/L）使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。每1mL溶液中含1mg的Hg，此液为汞浓溶液。精密量取汞浓溶液5mL于100mL量瓶中，用硫酸液（0.5mol/L）稀释至刻度，摇匀，即得。每1mL溶液中含50ug的Hg。 2.测定法 油乳剂疫苗消化：用经标定的1mL注射器（附15cm长针）正确量取摇匀的本品1mL，置25mL凯氏烧瓶（瓶口加小漏斗）中，加硫酸3mL、硝酸溶液0.5 mL，小心加热，待泡沸停止，稍冷，加硝酸溶液0.5-1mL，再加热消化，如此反复加硝酸溶液0.5-1mL消化，加热达白炽化，直至白炽化加热15min后，溶液