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1、第九章 吸光光度法,学时数：6学时,2020/7/21,2,第九章 吸光光度法(Spectrometer),2020/7/21,3,作业: P271: 1、2、4、5、9、10、13,2020/7/21,4,前 言,基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法。 包括比色法、可见分光光度法及紫外分光光度法等。 比色法(Colorimetey)：比较颜色深浅来测定物质浓度的方法。 分光光度法(Spectrophtometer)：应用分光光度计来进行比色分析的方法。（又称吸光光度法） 分光光度法特点： 1 灵敏度高：达10-510 -6 mol/L。适用于微量组分的测定。 2 准确度高：
2、相对误差为2 5%，满足微量组分测定的要求 。 3 速度快、仪器操作简单、价格便宜。 4 应用广泛: 分析对象有无机物质和许多有机物质的微量成分。 用于化学平衡等理论的研究。,2020/7/21,5,9.1 吸收光度法基本原理(Basic Principle of Spectrophotometer),10.1.1 光的基本性质,光的电磁波性质,2020/7/21,6,光的波粒二象性,波动性,粒子性, ,E,光的折射,光的衍射,光的偏振,光的干涉,光电效应,E：光子的能量（J, 焦耳）, ：光子的频率（Hz, 赫兹）, ：光子的波长（cm）,c：光速（2.99791010 cm.s-1）,h：
3、Plank常数（6.625610-34 J.s 焦耳. 秒）,2020/7/21,7,单色光、复合光、光的互补,单色光,复合光,光的互补,单一波长的光,由不同波长的光组合而成的光,若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。,2020/7/21,8,表1 物质颜色与互补光颜色的互补关系,2020/7/21,9,9.1.2 物质对光的选择性吸收(Selectivity Absorption),物质的颜色与光的关系,完全吸收,完全透过,吸收黄色光,光谱示意,表观现象示意,复合光,2020/7/21,10,当光束照射到物质上时，光与物质发
4、生相互作用，于是产生反射、散射、吸收或透射。如下图， 如被照射的是均匀溶液，则光的散射可以忽略。,界面反射损失,入射光束,透射光束,界面反射损失,溶液散 射损失,2020/7/21,11,物质对光吸收的本质,一束光,能量,分子+h (原子),M + h = M* (基态) (激发态),h2(E),h3,3,仅当照射光光子提供的能量(h)与被照物质的基态与激发态能量之差E相等时才能发生吸收。不同的物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级，其能量差也不相同。所以物质对光的吸收具有选择性。,E=h,物质或 溶液,2020/7/21,12,吸收光谱或吸收曲线(absorption,spectrum)
5、 固定被测物质的浓度和吸光厚度，在不同的波长处测定其吸光度。以吸度为纵坐标，以测定波长为横坐标作图，即为吸收曲线。,定性分析与定量分析的基础,定性分析基础,定量分析基础,物质对光的选择吸收 不同物质吸收光谱不同 相同物质吸收光谱相同,在一定条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。 一定的物质，浓度增加，max不变，吸收程度成比例增加,2020/7/21,13,吸收光谱 Absorption Spectrum,纯 电子能态 间跃迁,分子内电子跃迁,带状光谱,锐线光谱,2020/7/21,14,(a) 联苯(己烷溶剂)；,一些典型的紫外光谱,(b) 苯(己烷溶剂)；,(c) 苯蒸汽；,(d) N
6、a蒸汽。,2020/7/21,15,9.1.3 光的吸收基本定律朗伯-比尔定律,A：吸光度；I0：入射光强度；I：透射光强度；k1 ：比例常数； b：液层厚度（光程长度）,1729年，Bouguer首先发现物质对光的吸收与吸光物质的厚度有关。 1760年他的学生Lambert更明确地指出：如果溶液的浓度一定，则光的吸收程度与液层的厚度成正比，这个关系称为朗伯定律。表示 为：,一、吸光度(absorbance),2020/7/21,16,1852年，Beer指出：光的吸收与吸光物质的数量有关；如吸光物质溶于不吸光的溶剂中，则吸光度与吸光物质的浓度成正比。即当单色光通过液层厚度一定的有色溶液时，溶
7、液的吸光度与溶液的浓度成正比。这个关系称为比尔定律。,式中c：有色溶液浓度 k2：比例常数,2020/7/21,17,a-为吸光系数，单位为 L/g cm, b单位cm, c单位g / L。 -为摩尔吸光系数，单位为 L/mol.cm, c单位为mol/L,两项合并得：朗伯-比尔定律,与a 的关系,式中M为物质的摩尔质量。,经研究：当一束单色光，通过任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质时，其吸光度与吸光厚度和物质浓度成正比。,是吸光物质在特定波长和溶剂的情况下的一个特征常数，数值上等于1mol/L吸光物质在1cm光程中的吸光度，是吸光物质吸光能力的量度。它可作为定性鉴定参数，也可反映方法灵敏
8、度。测定波长不同时，不同。,2020/7/21,18,二、透光度T(transmittance),吸光度与透光率的关系,T ： 透光率,A： 吸光度,T,T = 0.0 %,A = ,T = 100.0 %,A = 0.0,A = 0.434,T = 36.8 %,2020/7/21,19,四、工作曲线,工作曲线又称标准曲线或较正曲线。绘制时先配制一系列具有不同浓度吸光物质的标准溶液，然后在确定的波长和吸光厚度(光程)等条件下，分别测量其吸光度。以吸光度A为纵坐标，标准物质的浓度c为横坐标作图，即为工作曲线。,在多组分体系中，如果各种吸收物质之间没有相互作用，体系的总吸光度等于各组分吸光度之和
9、。,三、吸光度的加和性：,2020/7/21,20,例：Fe(II)的质量浓度为5.010-4 g/L的溶液，与1，10-邻二氮杂菲反应，生成橙红色配合物。该配合物在波长508nm，比色皿厚度为2cm时，测得A=0.19。计算1，2-邻二氮杂菲亚铁的 a 和 ,解：已知 c = 5.0 10-4 g/L, A=0.19, MFe=55.85,或：,2020/7/21,21,9.1.4 偏离朗伯比尔定律的原因,实际测定时，标准曲线往往不成直线，如图4，发生正偏移或负偏移，这种现象称为对朗伯-比尔定律的偏移。,一、物理因素,LB定律基本假设：入射光为单色。 实际上仪器发出的入射光是波长范围较窄的光
10、带组成的复合光。 设由1和2两束光组成，其吸光度分别为A和A”,对1,对2,偏离的原因有：,1 非单色光引起的偏离,2020/7/21,22,测定时入射光的总强度为(I0+I”0）,透射光的总强度 为(I1+I2)，因此所得吸光度值为：,将I1和I2代入得：,可见，1=2 时，A=bc，A与c成直线关系。 如果12 ，A与c则不成直线关系。 1，2 差别愈大，A与c之间的线性关系偏离也愈大。,2020/7/21,23,尽量选取吸光度随波长变化不大的谱带A的复合光进行测量，则A随波长变化小，的变化小，引起的偏离小，A与c基本为直线。若选用谱带B的复合光进行测量， 的变化大，A与c的线性关系也差。
11、,选取谱带A处作入射波长，还可保证吸光度最大，灵敏度最好。,故在选用入射光波长时，我们应考虑：,2020/7/21,24,2、非平行入射光引起的偏离,朗伯-比尔定律要求入射光平行垂直入射。若入射光束为非平行光，可能导致工作曲线产生正偏离。,3、介质不均引起的偏离,朗伯-比尔定律要求吸光物质溶液：均匀的、非散射的。 若溶液不均，如产生胶体或浑浊，当入射光通过该溶液时，除了一部分光被吸收外，还有一部分因散射而损失，使实测的吸光度偏高，从而使工作曲线产生正偏离。,2020/7/21,25,L-B定律的基本假设要求溶液中吸光质点是独立的，彼此间无相互作用，因此稀溶液能很好地服从该定律。 高浓度时(0.
12、01 mol/L)，由于吸收组分粒子之间的平均距离减小，相互影响邻近粒子的电荷分布，使吸光能力发生变化。即改变物质的摩尔吸光系数()。 其相互作用的程度与浓度有关，浓度增大，吸光度与浓度之间的关系偏离线性关系越大。所以一般认为比尔定律仅适用于稀溶液。,二、化学因素引起的偏离,1、高浓度引起的偏离,2020/7/21,26,Cr2O72- + H2O = 2H+ + 2CrO42- （橙色） （黄色）,L-B中浓度(c) 应指吸光物质的平衡浓度，即吸光型体的平衡浓度。 实际常用吸光物质的分析浓度。只有当平衡浓度等于或正比于分析浓度时，其吸光度符合比尔定律。但溶液中吸光物质常因缔合、离解、互变异构
13、，络合物的逐级形成，以及与溶剂的相互作用等而形成新的化合物或改变吸光物质浓度，这些都将导致偏离比尔定律。如,2、化学反应引起的偏离,2020/7/21,27,9.2 目视比色法及光度计的基本部件,c1,c2,c3,c4,以眼睛比较溶液颜色的深浅以测定物质含量的方法，称为目视比色法。常用的目视比色法是标准系列法,比色管,优点：设备简单，操作简便，不要求有色溶液服从比尔定律，广泛 用于准确度要求不高的常规分析中。 缺点：准确度不高，如溶液中存在第二种有色物质，无法测定。许多有色溶液不稳定，标准系列不能久存，经常用时配制，麻烦。,cx,一、 目视比色法,2020/7/21,28,二、光度计及基本部件
14、,两种方法的测定原理相同，只是获得单色光的方法不同，前者用滤光片，后者用棱镜或光栅等单色器。 由于两者均基于吸光光度测定，统称为光度分析法。 国产分光光度计类型主要有：72、721和725型。其主要部件和光路示意图如下。,光源,单色器,吸收池,检测系统,参比池,光电比色法：使用光电比色计测定溶液A进行定量分析的方法,分光光度法：使用分光光度计测定溶液A进行定量分析的方法,2020/7/21,29,2020/7/21,30,比色池盒,2020/7/21,31,紫外可见分光光度计,2020/7/21,32,光度计的基本部件和光学示意图,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,图6 7
15、2型分光光度计光学系统图 1-光源 2-进光狭缝 3-反光镜 4,7-透镜 5-棱镜 8-出光狭逢 9-比色皿 10-光量调节器 11-硒光电池 12-检流器,2020/7/21,33,各部件的作用及主要性能,1光源,可见光区：使用钨灯，加热到白炽时发出波长约为3202500nm的连续光谱。光强度与温度成正比，一般工作温度为26002870K(熔点3680K)。温度与电源电压有关，电压稳定，光强度稳定。 近紫外光区：使用氢灯或氘灯，产生180375nm连续光谱。,2020/7/21,34,将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。 由棱镜或光栅等单色元件及狭缝和透镜组成。,2 单色器,棱镜,棱镜
16、单器由棱镜、透镜和狭缝组成。单色的纯度决定于棱镜的色散率和出射狭缝的宽度。 玻璃棱镜对4001000nm波长的光色散较大，适用于可见光分光光度计。,光栅,光栅是利用光的衍射和干涉原理而进行分光作用。 具有色散均匀、工作波长范围宽、分辨率高等特点，一般用于中高档仪器中。,2020/7/21,35,滤光片,三棱镜分光,2020/7/21,36,各部件的作用及主要性能,3 吸 收 池,有玻璃和石英两种。 可见光区：用无色透明、耐腐蚀的玻璃比色皿； 紫外光区：用石英比色皿。其厚度分别为 0.5、1、2、3 cm的长方形或园柱形。,2020/7/21,37,4 检测 系统,测吸光度时，透过比色池的光强度先转为电流，这种光电转换器件称为检测器。要求检测器对测定波长范围的光有快速、灵敏的响应。且产生的光电流与光强度应成正比。 光电比色计及可见光分光光度计常使用硒光电池或光电管作检测器，采用检流计作读数装置，两者组成
