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1、重组蛋白的分离纯化,基因表达体系,1. 原核体系 2. 真核体系,大肠杆菌 (Escherichia coli),遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高； 基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰,枯草杆菌 (Bacillus subtilis),分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构； 无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解； 质粒不稳定，尚无商品化的表达载体,其 他,乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 沙门氏菌(Salmonella typhimurium) 苏云金杆(Bacillus thuring
2、iensis),真核细胞表达体系,酵母细胞 昆虫细胞 哺乳动物细胞/组织 植物细胞/组织,酵母细胞,可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达; 糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高; 商品化表达体系： 酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）; 毕赤酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）,昆虫细胞,可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白; 适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰； 糖链有所区别，表达量有限； 作为药物宿主细胞未被FDA认可,CHO
3、细胞,可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致； 表达量不够高，培养成本较高,动物乳腺组织,分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产； 转基因动物制作花费巨大，实验周期长,鸟类输卵管组织,分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便； 实验成本低，饲养费用低； 加糖方式可能与人有所不同,植物组织,植物可大面积种植，可以廉价大规模生产； 转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制； 表达量较难提高，分离纯化不方便,体系选择,研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞 多肽药物生产
4、: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织 疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 大多数沿用细胞培养产物进行灭毒 单抗生产: 杂交瘤细胞 工业酶生产: 各种微生物,重组蛋白的分离纯化策略,重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则,针对不同的产物表达形式采取不同的策略,针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型,多种分离纯化技术的联合运用,合适分离纯化介质的选择,针对不同的产物表达形式采取不同的策略,采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理； 采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体； 采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先
5、选用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。,针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型,等电点处于极端区域（pI5 或 pI8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白； 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲和层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（10-8- 10-4 mol / L）； 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的； 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的； 径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离
6、于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。,多种分离纯化技术的联合运用,在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：,应选择不同分离纯化机理的方法联合使用,应首先选择能除去含量最多杂质的方法,应尽量选择高效的分离方法,应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段,合适分离纯化介质的选择,常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：,对目标蛋白具有较高的分离效率,对目标蛋白不会造成变性,化学性能和机械性能稳定，重复性好,价格低廉,Protein purificati
7、on,Preparation of the bacterial lysate,It is a critical step. Optimal conditions maximize cell lysis and the fraction of the recombinant protein that is extracted while minimizing protein oxidation, unwanted proteolysis and sample contamination with genomic DNA. The lysis buffer should contain a str
8、ong buffer to overcome the contribution of the bacterial lysate, high ionic strength to enhance protein solubility, protease inhibitors and a reducing agent such as TECP to prevent oxidation of the protein.,About gel filtration,The choice of gel filtration as the next step after IMAC may be surprisi
9、ng, considering its lower resolving power compared with ion exchange or other adsorption chromatography methods, but this step is often sufficient after IMAC if the protein was abundant in the lysate. Moreover , gel filtration is more generic, can be performed in any buffer condition, and can be use
10、d to resolve the oligomerization state of the target protein. Superdex 75 and Superdex 200 prep grade, XK 16/60 columns are most useful for 1-30mg of protein in a sample volume of up to 7.5 ml.,分泌型战略表达重组蛋白的分离纯化策略,要分泌的多肽有一个疏水的氨基突出，它负责向内质网的转运 这个末端突出通常由大约20个氨基酸组成，并且在内质网中从成熟蛋白上剪切下来。 人们已经利用含有合适重组质粒的酵母细胞分
11、泌了大量的非酵母多肽，而且绝大多数情况下都用到了a-因子信号序列。,外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白。,外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在N端加入1530个氨基酸组成的信号肽（signal peptides）序列。信号肽N端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部为疏水氨基酸，它们对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用。当蛋白质分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与外膜之间的外周质时，信号肽被信号肽酶所切割。,以分泌型蛋白的形式表达外源基因的优点：,分泌型可能使蛋白质按适当的方式折叠，有利于形成正确的空间构相，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。甚至有
12、些在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌后则有活性。,分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞内蛋白酶所降解。 简化了发酵后处理的纯化工艺。,缺点：外源蛋白分泌型表达通常产量不高，有时信号肽不被切割或在不适当的位置发生切割。,人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究,1、重组载体的构建,特导引物设计，以pBV220-ALR质粒为模板扩增目的条带,构建酵母表达重组质粒，转化毕赤酵母GS115,重组蛋白的表达及鉴定,rhALR的纯化,rhALR的纯化,菌液上清经低盐透析后，超过DEAE-Sepharose FF柱的饱和吸附量上样，洗脱组分脱盐后再上DEAE-Sepharose F
13、F 柱，然后再用Sephades G-75 柱进一步纯化。,离子交换琼脂糖：,离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的Sepharose CL-6B,DEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型）的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因此具有稳定的外形体积。,离子交换介质的选择原则,对pI=5的某酸性蛋白质 当蛋白质为阴离子时， 在pH5.5-9.0的范围内， 应首选DEAE纤维素； 当蛋白质为阳离子时， 在pH3.5-4.5的范围内， 应首选CM纤维素,1,2,3,4,6,7,8
14、,9,10,5,pH,+,-,蛋 白 质 净 电 荷,等电点,吸附阴离子交换剂,吸附阳离子交换剂,pH pI（-）,What happens in ion exchange?,sample application and wash,elution,equilibration,regeneration,-,-,-,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,anion exchanger bead,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,equilibration,an
15、ion exchanger bead,-,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,sample application and wash,-,-,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,elution,+,+,+,+,+,+,regeneration,离子交换层析的基本操作,层析柱平衡,平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍,平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速,平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致,为准，其中pH值最重要,离子交换层析的基本操作,样品进柱,为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%,为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高,交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数,离子交换层析的基本操作,样品洗脱,恒定洗脱,阶段洗脱,梯度洗脱,10,20,30,40,50,60,70,80,90,分子浓度,离子强度,pH值,阴离子交换法,色谱条件： DEAE-Sepharose FF 阴离子交换填料；XK26/20色谱柱，体积89.32ml; 8ml/min; 0.2灵敏度 A液： 5ommol/L Tris-Hcl (pH8.0) B液：50mmol/L Tris-Hcl+1 mol/NaCl (pH8.0) 以A液为平衡液，B液为100%洗脱液，各洗脱浓度由Pha
