转录基本知识课件

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1、第三章 转录基本知识 RNA的生物合成,RNA Biosynthesis, Transcription,遗传信息传递的 中心法则,生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上。细胞分裂过程中，DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给子细胞。 子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。 一些RNA病毒能以自己的RNA为模板A为合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。,RNA 生物 合成主要内容,一， RNA 基本性质 1，RNA 化学结构 2

2、，RNA 分子结构 3，RNA 种类 及功能 二，转录的分子事件 1，转录概念 2，转录基本特点 3，转录发生过程（原核生物真核生物差异）： （1）转录的酶与蛋白因子 （2）转录启动区域：启动子 （3）转录的起始，延伸及结束 4，真核转录后加工 三：RNA降解 四：RNA转录应用,1，RNA 化学结构RNA /DNA Structure,RNA含有四种基本碱基，即腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。此外还有几十种稀有碱基。,2 RNA的分子结构,RNA的一级结构主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四种核糖核苷酸通过3，5磷酸二酯键相连而成的多聚核苷酸链。 天然RNA的二级结构，一般并不像DNA那

3、样都是双螺旋结构，只有在许多区段可发生自身回折，使部分A-U、G-C碱基配对，从而形成短的不规则的螺旋区。不配对的碱基区膨出形成环，被排斥在双螺旋之外。RNA中双螺旋结构的稳定因素，也主要是碱基的堆砌力，其次才是氢键。每一段双螺旋区至少需要46对碱基对才能保持稳定。在不同的RNA中，双螺旋区所占比例不同。 构。,3, RNA 种类及功能,RNA按功能不同分为三类，即 信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)及核蛋白体RNA(rRNA)。 在大多数细胞中RNA的含量比DNA多58倍。,RNA理化特点,RNA与DNA最重要的区别一是RNA只有一条链，二是它的碱基组成与DNA的不同，RNA没有

4、碱基T（胸腺嘧啶），而有碱基U（尿嘧啶）。所以导致他们有以下性质上的不同。 1.两性解离：DNA无，只有酸解离，碱基被屏蔽（在分子内部形成了H键）。RNA有，有PI。 2.粘度大：DNA;RNA，粘度由分子长度/直径决定，DNA为线状分子，RNA为线团。 3.碱的作用：DNA耐碱RNA易被碱水解。 4.显色反应： 鉴别DNA和RNA+浓HCl RNA - 绿色化合物 DNA - 蓝紫色化合物苔黑酚 二苯胺啡啶溴红（荧光染料）和溴嘧啶都可对DNA染色，原理是卡在分子中，DNA的离心和电泳显色可用它们。,5.溶解性：都溶于水而不溶于乙醇，因此，常用乙醇来沉淀溶液中的DNA和RNA。DNA溶于苯酚而

5、RNA不溶，故可用苯酚来沉淀RNA。 6.紫外吸收：核酸的m260nm，碱基展开程度越大，紫外吸收就越厉害。当A1时，DNA：50ug/ml，RNA和单链DNA：40ug/ml，寡核苷酸：20ug/ml。用A260/A280还可来表示核酸的纯度。 8.电泳：核苷酸、核酸均可以进行电泳，泳动速度主要由分子大小来决定，因此，电泳是测定核酸分子量的好方法。,紫外分光光度计 A260/A280和A260/A230的含义,A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。 A280nm 是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280

6、比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50蛋白质/DNA溶液 A230nm ，是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。 A260/A280和A260/A230 ：是核酸纯度的指示值，纯度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值应该在2.0 或2.5，A260 / A280的比值， 用于评估样品的纯度， 因为蛋白的吸收峰是280 nm。 纯净的样品比值大于1.8（DNA

7、）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。 A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0 。,在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA链为模板合成RNA，从而将DNA所携带的遗传信息传递给RNA的过程称为转录（transcription）。 经转录生成的RNA有多种，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA(small nuclear RNA和HnRNA等。,二，转录的分子事件 1，转录概念,mRNA携带了DNA的遗传信息，

8、在蛋白质合成中作为合成蛋白质的模板起传递遗传信息的作用。 tRNA的二级结构最具特色，呈三叶草型。其主要功能部位有二个，一是氨基酸臂的 3末端为-CCA-OH，起特异结合氨基酸作用；二是有一个反密码环，环上有反密码子，与mRNA上的密码子反向互补，于是由tRNA携带的氨基酸可被转运到与密码子对应的部位，因此tRNA具有携带转运氨基酸的作用。tRNA的三级结构为倒“L”型，是天然状态下的构象。 rRNA不单独存在，它与蛋白质结合为核蛋白体，分为大小亚基，存在于粗面内质网与胞浆中。核蛋白体是蛋白质生物合成的场所。 snRNA 参与RNA 剪辑,复制和转录的区别,转录是基因表达的中心环节,转录是以

9、DNA为模板合成RNA, 并且只是以单股DNA 为模板，因此具有不对称性； 用以转录的单链DNA, 称为模板链, 与复制不同，转录是局部的,从启动子开始到终止子结束,为一个转录单位; 转录不需要引物； 转录的忠实性相对弱； 转录首先得到RNA前体，然后再进行加工转变为成熟的RNA.,2，转录基本特点,Characters of RNA Biosynthesis,转录（transcription）的不对称性就是指以双链DNA中的一条链作为模板进行转录，从而将遗传信息由DNA传递给RNA。 对于不同的基因来说，其转录信息可以存在于两条不同的DNA链上。,（1）、转录的不对称性,能够转录RNA的那条

10、DNA链称为模板链(template strand) ，也称作反义链。 与模板链互补的另一条DNA链称为编码链(coding strand)，也称为有意义链。,模板链,编码链,编码链,模板链,模板链和编码链的相对性,模板链、编码链与转录及翻译的关系,RNA转录合成时，以DNA作为模板，在RNA聚合酶的催化下，连续合成一段RNA链，各条RNA链之间无需再进行连接。,（2）、转录的连续性,RNA转录合成时，只能向一个方向进行聚合，所依赖的模板DNA链的方向为35，而RNA链的合成方向为53。,（3）、转录的单向性,RNA转录合成时，只能以DNA分子中的某一段作为模板，故存在特定的起始位点和特定的终

11、止位点。 特定起始点和特定终止点之间的DNA链构成一个转录单位，通常由转录区和有关的调节顺序构成。,（4）、有特定的起始和终止位点,3，转录发生过程（1）参与转录合成的酶和蛋白因子,Enzymes and Protein Factors for RNA Biosynthesis,原料：NTP （ATP, UTP, GTP, CTP）。 模板：单链DNA。 酶：RNA聚合酶（RNA-pol）。 其他蛋白质因子：如转录因子、终止因子等。,参与RNA转录合成的物质,这是一种不同于引物酶的依赖DNA的RNA聚合酶（DNA dependent RNA polymerase，DDRP）。 该酶在单链DNA

12、模板以及四种核糖核苷酸存在的条件下，不需要引物，即可从53聚合形成RNA。,RNA聚合酶（DDRP）,原核生物中的RNA聚合酶全酶由五个亚基构成，即2。 亚基与转录起始点的识别有关，在转录合成开始后被释放；余下的部分（2）被称为核心酶，与RNA链的聚合有关。,原核生物的RNA聚合酶,核心酶 (core enzyme),全酶 (holoenzyme),原核生物RNA聚合酶的核心酶和全酶,原核生物RNA聚合酶亚基的功能,单因子RNA 聚合酶,T3,T7，sp6噬菌体RNA 聚合酶 200多个氨基酸组成的多肽 特异性多噬菌体上几个启动子进行转录。 体外获得单链或者双链RNA的最好的工具！ 简单，高效

13、。 RNA 聚合酶+T7/T3/T6启动子+ DNA 双联模板+终止子+ NTP+Mg2+ H2O,真核生物中的RNA聚合酶可按其对-鹅膏蕈碱的敏感性而分为三种，它们均由1012个大小不同的亚基所组成，结构非常复杂，其功能也不同。,真核生物的RNA聚合酶,在真核生物中，转录的起始过程较为复杂，现已发现数百种蛋白因子与RNA转录合成有关。 凡是与基因表达调控相关的蛋白因子统称为反式作用因子（transacting factor）。,转录因子,在反式作用因子中，直接或间接参与转录起始复合体的形成的蛋白因子被称为转录因子（transcriptional factor, TF）。 不同的RNA聚合酶存

14、在相应的转录因子，如与RNA聚合酶相关的转录因子包括 TFA，TFB，TFD，TFE，TFF，TFH等。,真核生物RNA聚合酶转录因子及其功能,协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（蛋白质）则称为终止因子 (termination factor)。 有的终止信号的作用可被特异的因子所阻止，使RNA聚合酶得以越过终止子继续转录，这称为通读(readthrough)，这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子(antitermination)。 原核生物中的终止因子蛋白是一种六聚体的蛋白质，亚基的分子量为50kd。 蛋白能识别转录终止信号，并与RNA紧密结合，导致RNA的释放。,终止因子,三：RN

15、A合成过程,起始,双链DNA局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,RNA,启动子（promoter),终止子(terminator),转录起始需解决两个问题： 必须准确地结合在转录模板的起始区域。 DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,1 起始：RNA聚合酶识别起始区,在原核生物中，若干功能相关的结构基因常常串联在一起，由其上游的同一调控序列进行调控，这种基因的组织形式称为操纵子（operon）。,1. 模板与酶的辨认识别：,DNA分子中参与转录调控的序列统称为顺式作用元件（cis-acting element）。 原核生物转录起始时，首先由RNA聚合酶中

16、的因子识别转录起始点，并促使核心酶结合形成全酶复合物。,位于基因上游，与RNA聚合酶识别、结合并起始转录有关的一些DNA调控序列被称为启动子（promoter）。 启动子序列通常由一些带共性的保守序列构成。,利用足迹法(footprint)和DNA测序法可以确定启动子的序列结构。 原理:DNA和蛋白质结合以后便不会被DNAase分解，在测序时便出现空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸对数目。在用酶移出与蛋白质结合的DNA后，又可测出被结合处DNA的序列。,足迹法确定启动子序列,原核生物启动子的保守序列,原核生物转录起始区的一致性序列,大肠杆菌启动子共有序列的功能,起点,被RNA聚合酶辨认的区段就是位于转录起始点-35区的TTGACA序列。 RNA聚合酶与该区结合后，即滑动至-10区的TATAAT序列（Pribnow盒），并启动转录。,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,氢键 结合于大小沟 解链区-9-+13, DNA局部双链解开。, RNA聚合酶全酶(2)与模板（启动子区）结合。,