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1、P C R 技术 DNA 体外快速扩增技术,一、基础知识,（一）DNA分子的结构,C、H、O、N、P,1、组成元素,脱氧核苷酸,2、基本单位,3、脱氧核苷酸结构,一个核苷酸上的磷酸基团上的“OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二脂键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3和5碳原子之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3、5、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“OH”末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端,4、多脱氧核苷酸链得形成,脱氧核苷酸结构式,多脱氧核苷酸链结构简图,5、DNA分子的双螺旋结构, DNA分子是由两条反向平行的（即
2、一条链为35，另一条链为5 3 ）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构,脱氧核糖与磷酸交替连结，排列在侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧,两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对,6、利用碱基互补配对规律的计算,规律一：DNA双链中的两条互补链的碱基相等,任意两个互补的碱基之和相等即A=T，G=C。任意两个不互补的碱基之和恒等，占碱基总数的50%。即：A+GT+CA+CT+G50%，（A+G）/(T+C)(A+C)/(G+T)(T+C)/(A+G)1,规律二：在DNA双链中的一条单链(A+G)/(T+C)的值与
3、另一条互补链的 (A+G) /(T+C)的值互为倒数关系,规律三：DNA双链中，一条单链的(A+T)/(G+C)的值与另一条互补链的(A+T)/(G+C)的值是相等 的，也与整个DNA分子中的(A+T)/(G+C)的值相等,（二）DNA分子的特性,1、稳定性,在DNA分子双螺旋结构的内侧，通过氢键形成的碱基对，使两条脱氧核苷酸长链稳固的并联起来,例题：甲DNA分子中，A和T占25，G和C占75%，乙DNA分子中，G和C占25， A和T 占75%，哪一个稳定？,答：甲DNA分子比乙DNA分子稳定。因为A与T之间形成两个氢键，在G和C之间形成三个氢键，三个氢键比两个氢键稳定，所以在DNA分子中含有
4、较多的GC碱基对比含有较多的AT碱基稳定,2、多样性,构成DNA分子的碱基对的数量不同，碱基对的排列顺序千变万化,例题：如果有4000个碱基对，碱基对有多少种排列方式？,答：碱基对排列方式有44000种,3、特异性,不同的DNA分子由于碱基对的排列顺序存在差异，因此每一个DNA分子的碱基对都有其特定的排列顺序，这种特定的排列顺序包含着特定的遗传信息，每一种生物(A+T)/(G+C)的比值是特定的,（三）DNA的复制,2、时期,有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期,3、场所,细胞核（主）、线粒体、叶绿体,4、模板,DNA母链,1、概念,由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程,5、原材料,脱氧核
5、苷酸,6、基本条件,酶、ATP、原料、模板,7、复制过程, DNA的解旋,亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链, RNA引物的合成,以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物, DNA的生成,以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5端3端合成DNA。,切掉引物生成冈崎片断,在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为冈崎片断, DNA片断的连接,在DNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形成一条完整的新的DNA链。新链与旧链构成新的DNA,边解旋边复制(
6、过程）,8、复制特点,半保留复制（结果）,9、遵循原则,碱基互补配对原则,10、精确复制的原因,11、复制的意义,DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性,规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板,碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行,一条双链DNA分子，复制N次，形成的子代DNA分子中，含亲代DNA母链的有两个DNA分子，占子代DNA总数的2/2N；亲代DNA分子母链两条，占子代DNA中脱氧核苷酸链总数的 2 / 2N+1 = 1/2N,设一条DNA分子中有胸腺嘧啶为m个，则该DNA复制n次后，形成子代DNA分子需游离的胸腺嘧啶为 T = (2N - 1)
7、m,12、DNA复制过程中的等量关系,（四） PCR(多聚酶链式反应）,1、 DNA聚合酶特性,不能从头合成DNA，只能从DNA的3端开始延伸DNA链，因此， DNA复制需要引物,2、 DNA聚合酶作用过程,当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链， DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸,3、 PCR原理,在80100C的温度范围内， DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性,当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链, PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上
8、也是一台能够自动调控温度的仪器,高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化,4、 Taq DNA聚合酶的应用,5、 缓冲液需要为PCR反应提供的物质,DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行,PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出,6、 PCR技术的特点,7、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别, PCR过程需要的引物不是R
9、NA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为2030个脱氧核苷酸,8、细胞内复制和PCR不同点, PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的,（五） PCR的反应过程,1、PCR的反应步骤,PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤变性、复性和延伸,变性（模板DNA解旋）,模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备,2、循环过程,复性（退火）,模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合,延伸,DNA模板引
10、物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链,3、30次循环后靶序列扩增的数量,4、PCR 循环的结果, DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增,从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸,二、 PCR 的实验操作,1、PCR仪,（一）设备及用具,实质上一台能够自动调控温度的仪器,2、微量离心管,一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL,3、微量移液器,用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次
11、性吸液枪头用一次更换一次,PCR仪,1、准备,2、移液,（二）实验操作步骤,按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上,用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂,过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁,注意：,3、混合,B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀,A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢,将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序,过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s,4、离心,5、反应,离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果,PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干
12、扰实验，PCR操作时要注意做到：,6、注意事项,隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；,分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头,（一）理论上DNA扩增数目的计算,三、课题成果评价,1 、一条DNA，复制 n 次， DNA为2n,2 、 a 条DNA，复制 n次， DNA为 a2n,（二）实验中DNA含量的测定,1 、原理,可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关,2 、过程,稀释,2 uL PCR反应液，加入98 uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释,对照调零,以蒸馏水作为空白对照，
13、在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零,取DNA稀释液100 uL至比色杯中，测定260 nm处的光吸收值,测定,计算公式,DNA含量(g /mL)50(260 nm的读数)稀释倍数,说明（50 的含义）：1 g /mL的DNA在厚度为1 cm比色杯中在260 nm处的吸光值为 0.02）,比色杯,四、 课题延伸,例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）,PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出特点,五、实验小结,PCR仪加热使（ ）变性, 复性使引物与模板DNA（ ）,延伸需将反应温度升至中温( ),在（ ）的作用下,以 （ ）为原料,以（ ）为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,经（ ）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。,模板,互补,Taq聚合酶,四种脱氧核苷酸,引物,变性、复性和延伸,72,
