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1、第六节 药物的抗病毒实验,一、目的和要求 1.掌握药物体外抗病毒的实验方法和操作步骤。 2.熟悉病毒感染性动物模型的建立和评价。,二、内容 （一）原理 病毒是一类结构简单、非细胞形态的专性细胞内寄生的微生物，必须在易感的活的动物、鸡胚或细胞内才能进行复制增殖。因此可用动物、鸡胚或细胞来进行病毒培养和药物的抗病毒试验。可通过观察细胞培养液酸碱度的变化、病毒致细胞病变效应（CPE）、病毒滴度（PFU）改变、病毒基因组mRNA水平变化、鸡胚尿囊液或动物血清等相应指标的改变，来判断药物的抗病毒试验效果。,（二）材料 1. 910 d日龄鸡胚，壳白净且厚薄均匀的鸡卵（莱亨鸡的受精卵由于卵壳薄，在孵育过程
2、中便于检查，为首选） 2. Hep-2细胞或MDCK细胞 3.病毒：如IFV（FM1株）、RSV（Long株） 4.药物：试验药物，阳性对照药 5.动物：小鼠等 （三）操作方法,鸡胚培养为常用的病毒培养法之一，目前主要用于痘类病毒、粘病毒、疱疹病毒的分离、鉴定、制备抗原和疫苗的生产等。 1.接种方法 病毒的鸡胚培养法主要有四种接种途径，即尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔和卵黄囊，不同的病毒应选择各自适宜的接种途径，并根据接种途径确定鸡胚的孵育日龄（见表）。下面将以流感病毒为例进行说明。,一）鸡胚法,2. IFV-FM1的50%鸡胚感染量（EID50）测定 用生理盐水将病毒作10倍系列稀释，分别接种鸡
3、胚，0.1ml /胚，同时设正常对照，共6组，每组5胚。35孵育72 h，置4冰箱过夜，收集尿囊液做血凝试验，按Reed-Muench法计算FM1的EID50。,3. 药物对鸡胚的毒性作用 选用健康的911日龄鸡胚，消毒备用。将受试药和对照药作10倍系列稀释56个浓度，如100mg/ml、10mg/ml、1mg/ml、100g/ml、10g/ml，每个浓度接种5胚，0.25ml /胚。35培养5 d后观察结果（死亡/存活）。确定两种药物对鸡胚的最大无毒剂量（TC0），用于正式实验。,4. 药物对FM1的抑制作用 鸡胚随机分为14组，每组5胚，即试验药的六个剂量组（从TC0开始作10倍系列稀释）
4、、阳性对照药六个剂量组（同前）、生理盐水和病毒对照组。将不同浓度的药液注入鸡胚中，0.25ml /胚，30 min后经相同途径注入100 EID50病毒0.1ml，对照组以生理盐水代替。35温箱孵育5 d。收获尿囊液，测其血凝效价，以能抑制32倍以上所注射的最小药物量，即为其最小抑制剂量（MIC）。,4.1鸡胚接种 （1）孵育910 d左右的鸡胚，在照蛋灯下用蜡笔标出气室和胎位。 （2）鸡胚直立于固定架上，气室端向上，按常规以碘酒，酒精消毒。 （3）用磨蛋器在气室中央磨一小孔，再用碘酒擦拭。 （4）用lml注射器吸取病毒悬液，针头从气室小孔刺入，沿胚胎的长轴刺入0.51.0cm深度；此时针头已
5、在尿囊腔中，注入0.2ml病毒悬液。 （5）拔出针头，用镊子将胶布沾酒精烧灼后将小孔封闭，置于3536温箱内培养二天，每天翻动两次，用照蛋灯检视一次。培养二天后。置 -20冰箱2 h后，无菌操作收获尿囊液。,4.2尿囊液的收获 （1）从冰箱中取出鸡胚，用碘酒，酒精消毒气室部位。 （2）用无菌镊子除去胶布并去除气室部分的卵壳。 （3）用无菌的毛细吸管插入尿囊腔中轻轻吸取尿囊液（避免血管破裂），置于无菌试管中。 （4）获得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑制试验（定性），判断病毒的增殖情况并对病毒进行鉴定；同时做无菌实验。,4.3血凝和血凝抑制实验 （1）血凝实验 血凝实验的具体操作方法，参照本教材的
6、第四章第四节内容：病毒的分离培养鉴定和血清学检测。 结果判断 以“+”号多少表示血凝程度： + 100的RBC发生血凝，形成花边拉网状，红细胞呈薄层均匀铺于板孔底，呈细沙状或薄膜状； + 75的RBC发生血凝，红细胞虽铺于孔底，呈细沙状，但边缘不整有下沉趋势； + 50的RBC发生血凝，红细胞在孔底呈一环状，四周有小凝集块； + 25的RBC发生血凝，红细胞在孔底沉聚呈小圆点，边缘不光滑，周围有小凝集块； - 100的RBC沉积，红细胞于孔底呈一小圆点，边缘光滑整齐，无凝集现象。 以使50的RBC发生凝集的最高稀释倍数，为病毒的血凝效价。计算药物的MIC。,（2）病毒血凝抑制实验 根据血凝试验
7、滴定的病毒血凝效价，以“2”的凝集者含有1个病毒血凝单位。如流感病毒的血凝效价为1:160，即病毒液稀释至1:160时，每0.25ml中含1个血凝单位，若要将0.25ml病毒液配制成含4个血凝单位时，应稀释成1:（1604），即1:40稀释。在做血凝抑制试验时用4个血凝单位。 将病毒液配成4个血凝单位。血凝抑制实验的方法，参照本教材的第四章第四节内容：病毒的分离培养鉴定和血清学检测。,主要根据细胞对病毒的敏感性选择适宜细胞株。人类病毒用人或猴的组织较敏感，因此，研究人的病毒性疾病常用人胚肾、人胚肺或人羊膜细胞。组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株
8、和传代细胞系三种类型。本实验仅介绍对传代细胞的操作方法。,二）细胞培养法,1.病毒TCID50滴定 （1）原理 多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态学改变，如细胞团缩、裂解和细胞肿大等，这种改变称为病毒致病变效应（cytopathic effect，CPE），可以直接通过显微镜观察，亦可通过染色得以识别和判断。CPE的程度可间接反映病毒的毒力，因此利用这种特征可以用来测定病毒的毒力。即能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞发生病变所需的病毒量，定义为病毒的50组织细胞感染指数（50tissue culture infectious dose，TCID50）。在从事药物的抗病毒试验中，常用
9、100 TCID50的病毒感染量进行。,测定时，首先在微量细胞板上培养敏感细胞，待细胞贴壁形成单层，弃上清。将待测病毒用维持液做连续10倍系列稀释后加入细胞单层，逐日观察，直至病毒产生的CPE不再进展为止。具体时间根据病毒的增殖特点而定，如肠道病毒增殖迅速，一般48 h即可；RSV、VSV增殖也较快，因此4872 h也可以观察、染色、计算。,（2）实验材料 细胞：MDCK细胞或Hep-2细胞，或其它敏感细胞。 病毒：流感病毒（IFV）或呼吸道合胞病毒（RSV）。 试剂：DMEM细胞培养基，新生小牛血清，胰蛋白酶或VTP消化液，PBS，青霉素100U/ml、链霉素100 U/ml，MTT (4,
10、5-二甲基噻唑-2,5-二苯基四唑溴化物)，结晶紫染液等。 材料：细胞培养板（1块/组），tip头（2盒/排），微量移液器，5ml或10ml吸管（2支/组），青霉素瓶带塞（10个/组），酒精缸，镊子（2个/组），1ml注射器，毛细吸管等。,（3）操作步骤 1）制备细胞 将细胞生长面朝上，轻轻倒掉瓶中培养液，用PBS小心洗涤2次，注意吸管尖头不要伸到细胞瓶中。 用上述吸管吸取1ml VTP加入细胞瓶中，铺满整个细胞生长面即可；室温或手握住消化，约35min。当细胞胞质回缩、细胞间隙增大呈拉网状后，即可停止消化，尽可能弃尽消化液，继续利用残余的消化液消化，直至细胞大部分易在外力作用下从细胞瓶表面脱
11、落下来为止。,加入适量营养液到细胞瓶中，用小头吸管吹打瓶壁细胞以及脱落细胞充分使细胞均匀，吹打时动作要轻柔不要用力过猛，尽可能不要出现泡沫。吸一滴细胞悬液于Ep管中。 计数：用吸管吹打细胞悬液，取少许细胞悬液与等量0.04台盼兰混匀，在计数板上盖玻片的一侧加该细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。当细胞密度为106/ml时即可。 一瓶细胞消化后加入适量营养液制成所需细胞悬液，浓度约为1106/ml。用微量移液器将细胞悬液加入40孔板微孔中，每孔100l，37、5%CO2孵育箱培养24 h，形成单层后，做病毒滴定用。,2）50%组织细胞感染量（TCID50）测定 稀释病毒液：取无菌
12、青霉素瓶9支，各管分别加3%小牛血清的维持液2.7ml，然后向第一管加IFV病毒液0.3ml，反复吹吸混合三次，从第一管内吸液0.3ml加入第二管内，反复混合三次，从第二管内吸液0.3ml加入第三管内，反复混合三次，依此类推将待测的病毒液做连续10倍稀释，使病毒稀释为10-1，10-2，10-3 10-9。,病毒接种：将长好单层细胞的培养板各孔细胞液全部倾弃，用微量移液器把各稀释度的IFV病毒从低浓度开始依次加入各微孔中，每稀释度平行加2孔，每孔100l。细胞对照孔不加病毒液，只加维持液。置37、5%CO2孵育箱中孵育。 结果观察：于孵育后18、24、36、48、72h在倒置显微镜下观察CPE
13、，病毒可引起细胞圆缩、堆聚及脱落等现象。“-”表示细胞正常；“+”表示有25%细胞产生病变、圆缩、破碎脱落；“2+”有50%细胞产生病变；“3+”有75%细胞产生病变；“4+”有75%以上细胞产生病变（实验时，有的观察24h48 h即可染色计算；或逐日观察CPE，直至病毒产生的CPE不再进展为止）。,3）按Reed-Muench法计算TCID50，参见下表：,按表中可见，10-3稀释的病变高于50%；10-4稀释的病变低于50%；50%病变分布于10-3与10-4之间，计算公式如下： 高于50%病变率 -（50%） 距离比例= - 高于50%的病变率-低于50%的病变率 lg稀释倍数 100-
14、50 = - 100-25 lg10= -0.67 lg TCID50 =高于50%病变的低稀释度对数+距离比= -3+(-0.67)=-3.67 即1个TCID50=10-3.67，查0.67的反对数为4.68，即病毒做4.68103倍稀释时取0.1ml接种细胞，可使50%细胞产生病变。,附录：如何计算200个TCID50？ 4.68103200=23.4，将病毒作23.4倍稀释时即得200个TCID50。 按计算结果，用100个TCID50病毒进行药物的体外抗病毒试验。,2.病毒增殖及病毒感染单位量测定 2.1病毒增殖 将冻存的病毒株复苏后接种于敏感细胞进行增殖，23 d后出现典型细胞病变
15、，待病变达8090时收获病毒。反复冻融3次并低速离心取上清，分装后用空斑形成单位实验（plaque forming unit, PFU）测定病毒的感染量，保存于-80备用。在进行药物的抗病毒试验中，亦可用该实验测定药物对病毒增殖的影响，而且结果可能更准确、可靠。,2.2病毒感染单位量测定 用 PFU 表示。 以5.0105 /ml的密度接种敏感细胞于6孔细胞板中。置37、5CO2细胞培养箱中培养，使其24 h内长成单层； 在冰盘上操作，用维持液将病毒作10倍连续系列稀释（10-110-8）（操作如下图所示）；,注：即在一系列2ml的Ep管中先加入1.8ml维持液，取0.2ml病毒加入第一只Ep
16、管中，充分混匀后病毒稀释度为10-1，取混合后的0.2ml病毒悬液加入第二只Ep管中作为稀释度10-2，依此类推作系列稀释，则得到连续10倍稀释的病毒悬液。,弃去细胞培养板中各孔中的营养液，每孔接种相应稀释度的病毒悬液0.5ml，每个稀释度重复3孔。37吸附2 h，每15min摇动数下以保证病毒吸附分布均匀； 弃去各孔中的病毒液，PBS轻轻洗涤一次。每孔加入2ml覆盖层（含6新生牛血清的DMEM与1.5琼脂糖等体积混匀，配好后立即使用，以免凝固），水平放置15min使其凝固；,33，5CO2细胞培养箱中培养3 d。剔除覆盖层，每孔加入1ml 0.5结晶紫染色10min，自来水冲洗后选择空斑数清晰且易于分辨的稀释度计数空斑，根据空斑数计算病毒的PFU。下图显示的是RSV的空斑形成实验结果。 PFU的计算方法： ab PFU v （PFU：空斑形成形成单位/ml； a：空斑均数；b：病毒稀释度的倒数；v：病毒量/ml）,1：正常对照；26：病毒稀释度分别为 104，10
