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1、单克隆抗体制备实验,Caspar Gu,2011-4-12,目录,实验目的,实验原理,实验材料,实验步骤,注意事项,一、实验目的,了解并掌握单克隆抗体的制备原理； 熟悉单克隆抗体的制备过程； 熟练掌握无菌操作技术。,二、实验原理,三、实验材料,超净工作台、恒温培养箱、超低温冰箱、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机、37水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。,剪刀、镊子、解剖板、平皿（直径为10cm），15ml/50ml一次性离心管，50ml玻璃融合管200目不锈钢细胞筛，玻璃注射器针芯，10ml玻璃注射器（9号针头）,融合前一周复苏，第二天换液，长满后传代，融合前一天换液。一次融合需2
2、3瓶（75m2）Sp2/0细胞。,四、实验步骤(1),1. 取饲养细胞 取一只SPF级6-8周龄ICR小鼠，断颈处死，置75%乙醇中消毒5min 取一只10ml玻璃注射器，吸入78ml含10%FBS、HAT的RPMI1640培养基，剪开皮肤、沿切口上下撕开皮肤，充分暴露腹部，换镊子，拎起腹膜，沿腹部中线偏左下方进针，针头不要进入内脏器官，取一个干净的酒精棉球轻轻挤压小鼠腹部，同时反复吹打注射器，反复3-5次，待培养基变黄后将其转移到80mlHAT培养基中，备用。,2. 取免疫小鼠脾脏 免疫小鼠摘眼球取血后断颈处死，置75%乙醇中消毒5min 将高压过的细胞晒放到平皿中，细胞晒中加入10ml左右
3、的无血清1640，小鼠左侧卧位，剪开皮肤，沿切口上下撕开皮肤，可以看到脾脏所在位置；换剪刀、镊子，剪开腹膜，充分暴露脾脏；换剪刀、镊子，镊子轻轻夹住脾脏，用剪刀分离脾脏，尽量不要带结缔组织，将脾脏放入钢网中，用无菌的针头戳几下，用玻璃针芯轻轻挤压脾脏直至仅剩包膜，用几毫升无血清1640冲洗针芯和细胞晒，将滤液置于50ml离心管中，备用。,3. 收集Sp2/0细胞 取已长满的Sp2/0细胞23瓶，用弯头尖吸管将细胞吹下来，置于50ml离心管中，原瓶补液继续培养 4. 清洗脾细胞和Sp2/0 细胞 800rpm，离心5min 弃上清，轻轻磕几下50ml离心管底部（使细胞团块松散），加入两吸管无血清
4、1640，轻轻吹打均匀，补培养液至20ml 脾细胞和Sp2/0 细胞，800rpm，离心5min 5. 融合 将PEG1500置于37水浴锅上，熔化后，加入0.5ml无血清1640，混匀，即为50%PEG 取离心好的脾细胞和Sp2/0细胞，弃上清（注意保持这个姿势）用滤纸条轻轻沾去管壁上的培养液（保证PEG不被稀释）。将离心管放到37水浴中（用一小烧杯制备水浴），1min加入PEG（边加边搅），搅30sec；静止1min。,四、实验步骤(2),四、实验步骤(3),6. 终止 将一吸管无血清培养液在1min内加入细胞中，动作尽量轻柔，边加边搅。（此时，细胞在PEG作用下已变形皱缩，加液太快，动作
5、过粗，会引起细胞破裂死亡。）随后，不用计时，但仍要慢慢滴加培养液，最后补液至20ml。 800rpm，离心5min 7. 铺板 弃上清，细胞团块溶于100ml HAT培养液（前面已经准备好的）内，充分混匀后，铺板5-7块。置于37，5%CO2培养箱,第二天检查是否污染，第五天计算融合率，第七天换液（一定要沿孔壁把原孔液体吸干净），第十天检测。,五 . 注意事项,1 .无菌操作：单克隆抗体的制备过程需要严格无菌，包括使用的器械、试剂等均需要无菌处理， 注意实验操作中的无菌操作; 2. 用于免疫的动物，应选择与亲本骨髓瘤细胞同一品系的动物; 3. 抗原免疫用的抗原尽量设法提高其纯度，并保存其活性 ; 4. 融合剂PEG对细胞有毒性，一般采用分析纯规格；浓度越高，对细胞 的毒性越大。,
