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1、,PCR检测肝病毒的现状及进展,HBV慢性携带者（3.5亿慢性携带者）（分布）百分率, 2% 低分布区,2-7% 中度分布区, 8% 高度分布区,乙肝病毒感染呈全球性分布,中国是乙肝“大国”,乙肝是我国一个威胁健康的严重问题,每年有35万人死于乙肝病毒引起的肝脏疾病 其中18万人死于乙肝病毒引起的肝癌,1.2亿乙肝病毒携带者,3000万慢性乙肝患者,“十一五”重大传染病专项计划病毒性肝炎重大研究专项启动,2009年，我国病毒性肝炎领域最重要的进展是国家“十一五”重大传染病专项计划“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项启动（见表1）。 这是“十一五”期间与“载人航天与探月工程、大型飞
2、机”等相平行的16个重大专项计划之一。,表1 、国家中长期科技发展规划纲要（20062020年）确定的重大科技专项,HBV 复制周期(Replication cycle of HBV),慢性乙肝的本质是由病毒引发的免疫清除给肝细胞带来的损伤,免疫系统,主 题,肝病毒PCR检测的临床需求及现状 高精度肝病毒PCR检测技术介绍,血清HBV DNA水平是临床上评价HBV复制情况的“金标准”,Lok AS, et al. Hepatology. 2009;50:661-662 Liaw YF, Liver International, 2009,29(s1):100-1-7,慢性乙肝病毒感染的自然史,
3、急性HBV 感染,慢性携带者,康复,3050 年,慢性 乙肝,稳定,进展,肝硬化,代偿性肝硬化,肝癌,死亡,失代偿肝硬化(死亡）,HBV DNA高载量是肝硬化发生的重要相关因素, N=3,774; p value for log-rank test, 0.001,Chen CJ et al JAMA 2006;295:65 Iloeje U et al Gastroenterology 2006,130:678-686,全球权威指南一致认为：乙肝治疗的根本目的在于长期持续抑制病毒复制，阻止疾病进展,“持续抑制病毒复制，减轻肝脏炎症、坏死，从而延缓和阻断肝硬化和肝癌的发生”,抗病毒治疗为什么需要
4、长期？,病毒很难除“根”cccDNA,抗病毒治疗只是抑制病毒复制,停药后，病毒“复活”，导致疾病反复、进展,需要长期抗病毒治疗,长期抗病毒治疗带来的益处,抑制乙肝病毒复制，延缓疾病进展,提高生活质量，延长存活时间,调节乙肝患者的精神状态，减轻心理压力,减轻家庭经济负担和家庭成员的负担,目前常用的抗病毒药物:,干扰素 普通干扰素 聚乙二醇干扰素-2a(PEG-IFN-2a) 核苷(酸)类似物 拉米夫定 阿德福韦酯 恩替卡韦 替比夫定等,干扰素治疗有哪些优点和缺点？,干扰素是通过调节机体免疫力达到治疗目的 优点： 疗程固定 缺点： 为注射制剂，使用不方便 降病毒能力不强 副作用较大 禁忌症较多 耐
5、受率低,EASL Clinical Practice GuidelinesJournal of Hepatology 50 (2009) 227242,核苷类药物治疗有哪些优点和缺点？,核苷类药物直接抑制病毒复制 优点： 降病毒快速、强效 为口服制剂，使用方便 不良反应少 缺点： 有耐药性 疗程不确定,EASL Clinical Practice GuidelinesJournal of Hepatology 50 (2009) 227242,现有的抗病毒药物,-干扰素 拉米夫定 阿德福韦酯、聚乙二醇干扰素等,80年代,90年代后期,2005年后,反应乙肝病毒载量金标准：乙肝病毒DNA检测,H
6、BV DNA：乙肝病毒脱氧核糖核酸，可直接了解 体内病毒载量和复制情况；并可用于判断抗病毒治 疗的效果。,2012： HBV DNA detection and HBV DNA level measurement are essential for the diagnosis, decision to treat and subsequent monitoring of patients (A1). Follow-up using realtime PCR quantification assays is strongly recommended because of their sensit
7、ivity, specificity, accuracy and broad dynamic range 3841 (A1).,2009： Recently, HBV DNA assays that utilize real-time PCR technology with improved sensitivity(5-10 IU/mL) and wider dynamic range (up to 8-9 log10 IU/mL) have become available,乙肝治疗指南：美国和欧洲,Hepatology, 2009 J Hepatol, 2012,HBV DNA载量PCR检
8、测的国际指南,谁需要检测： HBsAg阳性患者和HBsAg阴性的高危人群 携带者、慢乙肝患者、肝硬化和肝癌患者 什么时候检测： 未治疗患者、治疗前、治疗中、结束治疗后均需检测,HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作用,HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作用,抗病毒治疗前病毒基线的准确测定： 适宜抗病毒治疗患者选择、抗病毒治疗方案的确定、抗病毒疗效的预测与后续疗效比对 抗病毒治疗过程中疗效的评估和方案优化、耐药突变检测和治疗终点的确认 抗病毒优化治疗停药后随访及复发再治的判断 隐匿性病毒性肝炎的诊断,高精度核酸定量检测是保证乙肝患者 走好抗病毒优化治疗之路的导航系统,HBV DNA
9、定量PCR检测的国际指南要求,超敏感（Hypersensitivity） HBV最低检测限10-15 IU/ml 宽线性范围（ wider dynamic range ） 涵盖101109 IU/ml 高特异性（ High specificity） 可重复性好（ Repeatability） （操作简单，或可自动化）,HBV DNA 检测临床应用发展,进口HBV DNA PCR试剂性能的比较,我国某些RT-PCR乙肝试剂盒的灵敏度及线性范围现状：,国产HBV DNA PCR试剂性能现状,现有的国产试剂在检测灵敏度、线性范围、可重复性等方面无法满足临床上日益增加的对HBV DNA定量准确性和灵敏
10、度的要求 部分试剂缺乏内标，影响定量准确性,中华检验医学杂志，2012,(无天、无地、无标、无法),HBV DNA定量使用低精度试剂的后果,临床实践中影响临床疗效的准确评估，从而使病人疗效出现偏差 临床研究中弱化抗病毒疗效,主 题,肝病毒PCR检测的临床需求及现状 超敏感肝病毒PCR检测技术介绍,磁珠法 在样本中加入超顺纳米磁珠，富集微量的病毒核酸分子，然后再扩增,动画演示,乙肝病毒核酸提取不同技术比较,磁珠法的性能之一,灵敏度达到 10 IU/ML 低浓度样本（10 IU/ml）的灵敏度检测结果图（重复90次，检出率为100%）,线性范围宽： 20 IU/ml2.00E+09 IU/ml,磁
11、珠法的性能之二,重复性好，精密度高批内(重复10次测试) 、批间(重复30次测试)Ct值变异系数（CV）均2%；浓度值对数值变异系数（CV） 8%,磁珠法的性能之三,抗干扰能力强，在高血脂、溶血、黄疸及药物治疗后等异常样本时，提高了检测的可靠性,磁珠法的性能之四,操作简单，过程温和，提取快速。与其它方法相比，无需加热、无需高速离心、无需分离上清液或磁珠颗粒,磁珠法的性能之五,圣湘高精度HBV DNA试剂性能多中心评测,研究单位 负责人 中南大学湘雅医院 谭德明 中国医科大学盛京医院 窦晓光 南方医科大学南方医院 陈金军,初步报告，2012,研究方法,502份慢性乙型肝炎患者的血浆或血清样本(来
12、自于三所医院的门诊和住院病人)，采集的标本-20-80低温冰箱保存，同时用Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan（CAP/CTM）HBV诊断试剂和湖南圣湘生物科技有限公司的磁珠法HBV DNA定量试剂进行检测。,圣湘磁珠法HBV DNA试剂与罗氏试剂比较研究结果,圣湘磁珠法HBV DNA试剂与罗氏试剂比较研究结果,罗氏试剂盒与圣湘磁珠法试剂盒检测结果比较统计表 罗氏试剂盒与圣湘磁珠法试剂盒检测结果的一致性分析： 阳性一致性百分比=468/472100%99.2% 阴性一致性百分比= 94/153100%61.4% 总一致性百分比=（468+94）/635100%8
13、8.5%,磁珠法HBV DNA检测试剂与罗氏试剂比较研究结果,罗氏试剂盒与圣湘磁珠法试剂盒检测均有定量结果的样本共407例 两种试剂定量差异: 罗氏：7份； 罗氏圣湘：14份,两种试剂定量检测结果的散点图,两种试剂检测结果的拟合优度情况（相关分析）,（回归分析）常数项和系数的检验结果,对检测均为阳性的样本，圣湘磁珠法试剂与罗氏试剂的定量检测结果具有线性相关，相关系数R=0.966；回归方程为：y=0.134+1.005x。,磁珠法HBV DNA检测试剂与罗氏试剂比较研究结果,圣湘磁珠法与其它磁珠法病毒核酸提取差异,圣湘生物磁珠法肝病毒试剂盒的性能,国内市场,北京佑安医院 北京首钢医院 郑州大学
14、第一附属医院 河南科技大学第一附属医院 河南省传染病医院 石家庄传染病医院 蚌埠医学院附属医院 长征医院 上海长海医院 陕西省人民医院 山西省人民医院,佑安医院,郑大一附院,陕西省人民医院,国内市场,武汉协和医院 湘雅一、二、三附属医院 广东省第二人民医院 湖南省人民医院 湖南省肿瘤医院 郴州市第一人民医院 福建医科大学第一附属医院 重庆大坪医院 超过300家三级医院,湘雅医院,武汉协和医院,广州金域医学检验中心,社会价值,2012年6月25日，人民日报头版头条新闻：从“杂交水稻之父”袁隆平到以“高性能炭/炭复合材料”拿下空缺6年的国家技术发明一等奖的黄伯云，以及荣获美国“国家科技奖章”、拥有
15、16项自主创新专利的戴立忠，一批科技领军人物在湖南涌现，一批后起之秀在湖南集聚。,核心技术领军人物-戴立忠 博士,2010年，中组部部长李源潮关心公司发展,改变，从现在开始,解读基因，扩增健康,标本类型,血清（2-3ML） 最好是使用EDTA抗凝全血标本，抗凝后6h内分离血浆。如使用血清标本，则需尽快（2h内）分离血清 不能用肝素、枸橼酸钠、草酸钾等抗凝剂,标本运送,快：标本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室或冰箱保存。 低温：放在28临时保存运送。尤其是RNA样本，应在加冰条件下运送。 生物安全：标本的运送还应考虑生物安全问题，应符合相应的生物安全要求。,标本保存,DNA样本：可在28下保存3d。 RNA/DNA样本：在-20以下冻存1-2周。 长期保存：-70以下冻存。,四轮驱动，市场前景好,临床价值大 收费空间高 技术很领先 发展成趋势,
