蛋白质样品的制备

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1、.,第二章 蛋白质样品的制备,.,蛋白质样品的制备是蛋白质组分析的基础 蛋白质样品制备包含：蛋白质分离、提取、纯化 蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具有难度的。,.,第一节 样品制备总则,一、为什么要进行蛋白质样品的制备 1.要从某些组织样品中寻找功能蛋白质，就要排除非蛋白质的影响。 2.目前实验条件下，双向电泳能分辨到1000-5000个蛋白质点（spot），而生物的蛋白种类多达10万种以上，

2、样品中的蛋白质种类也可达到1万种以上，但大部分蛋白质的拷贝数都很少，因此通过样品制备也可以起到浓缩蛋白质的作用。 3.消除各种细胞或组织混杂的影响,.,“在制备中丢失的蛋白是永远不可能在后面的 试验中弥补回来的”,.,二、样品制备的原则,1.尽可能采用简单的方法进行样品的处理 2.尽可能的提高样品的溶解度，使所有待分析的蛋白质样品全部处于溶解状态，且制备方法应具有可重现性。 3.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。 4.样品制备过程中，防止发生人为的蛋白质样品化学修饰.（加入尿素后加温不要超过37 ，防止氨甲酰化而修饰蛋白) 5.防止样品在等电聚焦时

3、发生蛋白质的聚集和沉淀 6.破坏蛋白质与其他生物大分子之间的相互作用，以产生独立的多肽链 7.有的研究中必须保持蛋白质的活性。 8.通过超速冷冻离心等方法清除所有的非蛋白杂质，对可能起干扰作用的高丰度或无关蛋白质也应去除 9.样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于-80 。勿反复冻融已制备好的样品。,.,三、流程,1.细胞或者组织、菌体的破碎 2.沉淀溶液样品中的蛋白质及清除杂质 3.蛋白质的纯化(重泡涨溶液稀释样品；三氯乙酸+冷丙酮）,.,第二节 样品破碎与分离蛋白质,一、样品的类型 1.整体样品 是生物个体小的物种（如微生物），可以整体 取样。 2.组织样品 有一个采样的过程，就是从整体部

4、分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。 3.细胞样品 包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长 的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细 胞）和从组织中分离同类的细胞样品。 4.可溶性样品 是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑 脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。,.,二、组织与细胞破碎 为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进 行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细 胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种 分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。 蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些 蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋

5、白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。,.,（一）温和的裂解方法 通常应用于组分比较简单的样品，例如组织培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、完整的线粒体或其它的细胞器。,.,1. 渗透裂解 非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级 应用对象： 血细胞、组织培养细胞。 操作步骤： 将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶 胀而释放出细胞内容物。,.,2. 冻融裂解 许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解 应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。 操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要 求为止。,.,3. 裂解液裂解 含有去污剂的裂解液处理细胞、组

6、织以裂解细胞 膜，使细胞内容物释放出来。 应用对象：组织培养细胞 操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行 悬浮处理。,.,4.酶裂解 有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解。 应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。 操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。,.,（二）、剧烈的蛋白裂解 常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞， 或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方 法可以使细胞完全破碎裂解。,.,1. 超声裂解法 超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细 胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。 应用对象：悬浮细胞 操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫， 样品

7、处理应在冰浴中进行。,.,2.压力杯法 在高压下迫使细胞穿过小孔径而 产生剪切力，从而裂解细胞。 应用对象：微生物细胞，如细菌、 霉菌、酵母细胞及含有 细胞壁的细胞。 操作步骤：将细胞悬浮液置于预冷 的压力杯中，施加压 力，然后收集挤出液。,.,3.研磨法 用研钵或研杵研磨细胞 应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。 操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研 磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。,.,4. 机械匀浆法 使用匀浆器破碎细胞或组织 应用对象：固体组织，如心脏、肝 脏、肾脏组织和细胞悬 液。 操作步骤：先尽量将组织剪成块， 然后加有蛋白酶抑制剂 的冷匀浆液进行匀浆， 过滤或离心收集。

8、,.,5.玻璃珠匀浆法 剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物 应用对象：细胞悬液或微生物 操作步骤：用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置 于结实的管子里。每克细胞（湿重） 加入1-3克玻璃珠，剧烈震荡1min， 冰浴1min。重复上述步骤。,.,三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解 当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这会严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备。另外，许多组织蛋白酶在PH超过9.0的时候会失活，因此在样品裂解液中出现Tris、碳酸钠和载体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这些方法可防止蛋白降解

9、，但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要应用蛋白酶抑制剂。,., PMSF(苯甲基磺酰氟） 是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/L,灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（DTT）或者-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减小，因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。 AEBSF 为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/L，作用与PMSF相似，但溶解性较好，且毒性低。但 是AEBSF可能会改变蛋白的等电点。,., 金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（EDTA） 乙二醇双四乙酸（EGTA） 通常应用

10、1mmol/L的工作浓度，通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。 肽蛋白酶抑制剂 亮抑酶肽（leupetin），它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂A（pepstatin A），抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑蛋白酶肽（aprotinin），抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素(bestatin),抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱中，其中胃蛋白酶抑制剂A在PH=9的时候不能抑制蛋白酶。,., 甲苯磺酰赖氨酸甲酮（TLCK），甲苯磺酰 苯丙氨酰氯甲酮（TPC

11、K） 通常浓度在0.1-0.15mmol/L，这些相同的成分不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。 Benzamidine 通常浓度为1-2mmol/L，抑制丝氨酸蛋白酶。 变性剂 在低温条件下处理。直接加入强变性剂8mol/L脲、 10TCA或2SDS。强碱下抑制酶活，许多组织蛋白酶在pH超过9.0的时候失活。,.,四、分离和提取蛋白质（蛋白质沉淀步骤） 这是一种可选择的方法。通常用于选择性清除杂质，如盐离子、核酸、脂类等会干扰二维电泳结 果。重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释的 样品。沉淀并不是完全有效的，某些蛋白在沉淀后 并不容易重悬。因此在样品的制备过程中，应用沉 淀的步骤可

12、能会改变蛋白的二维电泳图谱。,., 硫酸铵沉淀 （盐析） 原理：在高盐溶液中，蛋白倾向于聚合，并从溶液中沉淀下来。许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中。 步骤：蛋白浓度大于lmg/ml，缓冲液浓度大于50mmol/L,并含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌10-30min，通过离心沉淀蛋白。 然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的，因此，这种方法只能被用来预分离或富集蛋白。并且，残存的硫酸铵会干扰IEF,必须被清除。,., TCA沉淀（三氯醋酸沉淀） 这是一种有效的蛋白沉淀方法，将TCA加到提取液中，终浓度将高达10-20 。蛋白质可于 冰上沉淀30min。另外，组织样品可以直接用10 -20

13、 的TCA进行匀浆。这种方法可限制蛋白降 解和其它的化学修饰。最后用丙酮或乙醇清洗沉 淀，以除去TCA。 然而，蛋白质再溶解是很困难的，并且不能完全再溶。残留的TCA必须通过乙醇或丙酮彻底清除，若过多暴露与低PH溶液中可能导致某些蛋白降解或修饰。,., 丙酮沉淀 这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白，以清除许多杂质，如去污剂、脂类。 于提取物中加入至少3倍体积的冰丙酮，使蛋白在-20沉淀至少2h，再离心沉淀蛋白。残留的丙酮通过空气干燥或冻干除去。,., 在丙酮中用TCA沉淀 两者联合应用更加有效，通常用10TCA在丙酮中重悬裂解的样品溶液（含有0.01 -巯基乙醇溶液或20mmol/L DTT）。至少

14、在-20沉淀45min，通过离心沉淀蛋白，并用含0.01-巯基乙醇溶液或20mmol/L DTT 的冰丙酮清洗沉淀。通过空气干燥或冻干去除残留的丙酮。此方法仍然存在难再溶的现象。,., 用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀 这对于杂质含量高的植物样品很有效。 蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋酸铵洗涤几次，然后用丙酮清洗，残留的丙酮通过蒸发除去。但是这种方法比较复杂，并且耗时较多。,.,在蛋白质样品制备中，蛋白质裂解是指对样品蛋白质进行增溶性溶解的过程，其目的是破坏蛋白质与蛋白质分子、蛋白质与非蛋白质之间的共价与非共价相互作用；使蛋白质变性及还原

15、；去除非蛋白质组分，如核酸、脂类等。为了达到这一目的，在蛋白质样品制备过程中需使用表面活性剂、还原剂及离液剂。,第三节 蛋白质裂解技术,.,一、裂解液 在蛋白质组学研究中，蛋白质裂解是一个重要的环节。蛋白质间的分开与疏远程度关系到双向电泳的分离效果。选择适宜的裂解剂能够实现蛋白质间的良好分离，是提高双向电泳分离效果的一个有力措施。, 离液剂 尿素是常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构，使得蛋白变性并使蛋白酶失活。尿素作为一种中性的离液剂，通常在裂解液中的浓度为8mol/L。尿素可溶解和解折叠大多数的蛋白质，形成完全随机的构象，使所有的离子基团暴露于溶液中。近来硫脲的加入可以

16、进一步提高溶解度，特别是膜蛋白。在实际应用中，需要高溶解强度时，一般用2mol/L硫脲和5-8mol/L的尿素联合使用。,., 还原剂 还原剂主要是用来断裂蛋白分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白的溶解性。通常用的还原剂有-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或二硫赤藓糖醇（DTE)和三丁基膦（TBP）,目前常用的是DTT。,., 去污剂（表面活性剂） 去污剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。去污剂有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。经常使用的有阴离子去污剂SDS，非离子去污剂NP-40和TritonX-100，两性离子去污剂CHAPS。原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质的迁移位置。最初，两个相似的非离子去污剂NP-40和Tr