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1、.,第二章 蛋白质样品的制备,.,蛋白质样品的制备是蛋白质组分析的基础 蛋白质样品制备包含:蛋白质分离、提取、纯化 蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一步,无论后续采用怎样的分离或鉴定手段,样品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究的角度而言,要求样品制备尽可能获得所有的蛋白质,但是由于蛋白质种类多、丰度不一和物化特性多样等,要达到真正的全息制备是具有难度的。,.,第一节 样品制备总则,一、为什么要进行蛋白质样品的制备 1.要从某些组织样品中寻找功能蛋白质,就要排除非蛋白质的影响。 2.目前实验条件下,双向电泳能分辨到1000-5000个蛋白质点(spot),而生物的蛋白种类多达10万种以上,
2、样品中的蛋白质种类也可达到1万种以上,但大部分蛋白质的拷贝数都很少,因此通过样品制备也可以起到浓缩蛋白质的作用。 3.消除各种细胞或组织混杂的影响,.,“在制备中丢失的蛋白是永远不可能在后面的 试验中弥补回来的”,.,二、样品制备的原则,1.尽可能采用简单的方法进行样品的处理 2.尽可能的提高样品的溶解度,使所有待分析的蛋白质样品全部处于溶解状态,且制备方法应具有可重现性。 3.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解,低温和蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。 4.样品制备过程中,防止发生人为的蛋白质样品化学修饰.(加入尿素后加温不要超过37 ,防止氨甲酰化而修饰蛋白) 5.防止样品在等电聚焦时
3、发生蛋白质的聚集和沉淀 6.破坏蛋白质与其他生物大分子之间的相互作用,以产生独立的多肽链 7.有的研究中必须保持蛋白质的活性。 8.通过超速冷冻离心等方法清除所有的非蛋白杂质,对可能起干扰作用的高丰度或无关蛋白质也应去除 9.样品裂解液应该新鲜配置,并且分装冻存于-80 。勿反复冻融已制备好的样品。,.,三、流程,1.细胞或者组织、菌体的破碎 2.沉淀溶液样品中的蛋白质及清除杂质 3.蛋白质的纯化(重泡涨溶液稀释样品;三氯乙酸+冷丙酮),.,第二节 样品破碎与分离蛋白质,一、样品的类型 1.整体样品 是生物个体小的物种(如微生物),可以整体 取样。 2.组织样品 有一个采样的过程,就是从整体部
4、分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。 3.细胞样品 包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长 的细胞、周期性细胞样品(如红细胞、淋巴细 胞)和从组织中分离同类的细胞样品。 4.可溶性样品 是可溶性液体样品,如血清、血浆、尿样、脑 脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。,.,二、组织与细胞破碎 为了完全分析所有的细胞内蛋白,组织与细胞必须进 行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源(如细 胞、固体组织或者其它的生物材料),同时也依赖于这种 分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。 蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来,其会导致某些 蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化,因此蛋
5、白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。,.,(一)温和的裂解方法 通常应用于组分比较简单的样品,例如组织培养的细胞、血细胞和一些微生物,或者用于分析某一特定的细胞器,例如只需要裂解胞质蛋白、完整的线粒体或其它的细胞器。,.,1. 渗透裂解 非常温和的裂解方法,可进一步进行亚细胞分级 应用对象: 血细胞、组织培养细胞。 操作步骤: 将细胞悬浮于渗透胞溶液中,细胞溶 胀而释放出细胞内容物。,.,2. 冻融裂解 许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解 应用对象:细菌细胞、组织培养细胞。 操作步骤:使用液氮,快速反复冻融至符合实验要 求为止。,.,3. 裂解液裂解 含有去污剂的裂解液处理细胞、组
6、织以裂解细胞 膜,使细胞内容物释放出来。 应用对象:组织培养细胞 操作步骤:将细胞直接置裂解液或样品液中,进行 悬浮处理。,.,4.酶裂解 有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解。 应用对象:植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。 操作步骤:将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。,.,(二)、剧烈的蛋白裂解 常用于难于破碎的细胞,如固体组织内的细胞, 或具有坚硬细胞壁的细胞,如酵母细胞,这种方 法可以使细胞完全破碎裂解。,.,1. 超声裂解法 超声仪可以产生超声波,通过切应力来裂解细 胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。 应用对象:悬浮细胞 操作步骤:要进行间歇处理,减轻产生热和泡沫, 样品
7、处理应在冰浴中进行。,.,2.压力杯法 在高压下迫使细胞穿过小孔径而 产生剪切力,从而裂解细胞。 应用对象:微生物细胞,如细菌、 霉菌、酵母细胞及含有 细胞壁的细胞。 操作步骤:将细胞悬浮液置于预冷 的压力杯中,施加压 力,然后收集挤出液。,.,3.研磨法 用研钵或研杵研磨细胞 应用对象:固体组织细胞、微生物细胞。 操作步骤:组织或细胞通常冻存于液氮中,随后研 磨成粉状,加氧化铝或砂有助于研磨。,.,4. 机械匀浆法 使用匀浆器破碎细胞或组织 应用对象:固体组织,如心脏、肝 脏、肾脏组织和细胞悬 液。 操作步骤:先尽量将组织剪成块, 然后加有蛋白酶抑制剂 的冷匀浆液进行匀浆, 过滤或离心收集。
8、,.,5.玻璃珠匀浆法 剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁,释放细胞内容物 应用对象:细胞悬液或微生物 操作步骤:用等体积的预冷裂解液重悬细胞,置 于结实的管子里。每克细胞(湿重) 加入1-3克玻璃珠,剧烈震荡1min, 冰浴1min。重复上述步骤。,.,三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解 当进行细胞裂解时,蛋白酶会释放出来,这会严重影响电泳的结果,因此需要采取一些策略。如果可能的话,直接加入强变性剂。蛋白酶在低温下无活性,因此尽可能在低温下进行样品制备。另外,许多组织蛋白酶在PH超过9.0的时候会失活,因此在样品裂解液中出现Tris、碳酸钠和载体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这些方法可防止蛋白降解
9、,但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持降解蛋白的活性。此时,需要应用蛋白酶抑制剂。,., PMSF(苯甲基磺酰氟) 是一种不可逆抑制剂,通常浓度为1mmol/L,灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶,但是其局限在于在水溶液中迅速失活,因此,现用现加效果较好;另外,在二硫苏糖醇(DTT)或者-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减小,因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。 AEBSF 为不可逆抑制剂,通常工作浓度为4mmol/L,作用与PMSF相似,但溶解性较好,且毒性低。但 是AEBSF可能会改变蛋白的等电点。,., 金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙(EDTA) 乙二醇双四乙酸(EGTA) 通常应用
10、1mmol/L的工作浓度,通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。 肽蛋白酶抑制剂 亮抑酶肽(leupetin),它是可逆性蛋白酶抑制剂,在含DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性,抑制一些丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的活性;胃蛋白酶抑制剂A(pepstatin A),抑制天冬氨酸蛋白酶的活性;抑蛋白酶肽(aprotinin),抑制许多丝氨酸蛋白酶;苯丁抑制素(bestatin),抑制氨基蛋白酶。但是,这些蛋白酶抑制剂价格昂贵,而且它们是小肽片段,可能会出现在二维电泳图谱中,其中胃蛋白酶抑制剂A在PH=9的时候不能抑制蛋白酶。,., 甲苯磺酰赖氨酸甲酮(TLCK),甲苯磺酰 苯丙氨酰氯甲酮(TPC
11、K) 通常浓度在0.1-0.15mmol/L,这些相同的成分不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。 Benzamidine 通常浓度为1-2mmol/L,抑制丝氨酸蛋白酶。 变性剂 在低温条件下处理。直接加入强变性剂8mol/L脲、 10TCA或2SDS。强碱下抑制酶活,许多组织蛋白酶在pH超过9.0的时候失活。,.,四、分离和提取蛋白质(蛋白质沉淀步骤) 这是一种可选择的方法。通常用于选择性清除杂质,如盐离子、核酸、脂类等会干扰二维电泳结 果。重悬之后的沉淀蛋白也可用来制备浓度稀释的 样品。沉淀并不是完全有效的,某些蛋白在沉淀后 并不容易重悬。因此在样品的制备过程中,应用沉 淀的步骤可
12、能会改变蛋白的二维电泳图谱。,., 硫酸铵沉淀 (盐析) 原理:在高盐溶液中,蛋白倾向于聚合,并从溶液中沉淀下来。许多潜在的杂质(如核酸)将保持在溶液中。 步骤:蛋白浓度大于lmg/ml,缓冲液浓度大于50mmol/L,并含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和,搅拌10-30min,通过离心沉淀蛋白。 然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的,因此,这种方法只能被用来预分离或富集蛋白。并且,残存的硫酸铵会干扰IEF,必须被清除。,., TCA沉淀(三氯醋酸沉淀) 这是一种有效的蛋白沉淀方法,将TCA加到提取液中,终浓度将高达10-20 。蛋白质可于 冰上沉淀30min。另外,组织样品可以直接用10 -20
13、 的TCA进行匀浆。这种方法可限制蛋白降 解和其它的化学修饰。最后用丙酮或乙醇清洗沉 淀,以除去TCA。 然而,蛋白质再溶解是很困难的,并且不能完全再溶。残留的TCA必须通过乙醇或丙酮彻底清除,若过多暴露与低PH溶液中可能导致某些蛋白降解或修饰。,., 丙酮沉淀 这种有机溶剂通常用来沉淀蛋白,以清除许多杂质,如去污剂、脂类。 于提取物中加入至少3倍体积的冰丙酮,使蛋白在-20沉淀至少2h,再离心沉淀蛋白。残留的丙酮通过空气干燥或冻干除去。,., 在丙酮中用TCA沉淀 两者联合应用更加有效,通常用10TCA在丙酮中重悬裂解的样品溶液(含有0.01 -巯基乙醇溶液或20mmol/L DTT)。至少
14、在-20沉淀45min,通过离心沉淀蛋白,并用含0.01-巯基乙醇溶液或20mmol/L DTT 的冰丙酮清洗沉淀。通过空气干燥或冻干去除残留的丙酮。此方法仍然存在难再溶的现象。,., 用苯酚提取,随后在甲醇中用醋酸铵沉淀 这对于杂质含量高的植物样品很有效。 蛋白质被提取到饱和酚中,然后在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋酸铵洗涤几次,然后用丙酮清洗,残留的丙酮通过蒸发除去。但是这种方法比较复杂,并且耗时较多。,.,在蛋白质样品制备中,蛋白质裂解是指对样品蛋白质进行增溶性溶解的过程,其目的是破坏蛋白质与蛋白质分子、蛋白质与非蛋白质之间的共价与非共价相互作用;使蛋白质变性及还原
15、;去除非蛋白质组分,如核酸、脂类等。为了达到这一目的,在蛋白质样品制备过程中需使用表面活性剂、还原剂及离液剂。,第三节 蛋白质裂解技术,.,一、裂解液 在蛋白质组学研究中,蛋白质裂解是一个重要的环节。蛋白质间的分开与疏远程度关系到双向电泳的分离效果。选择适宜的裂解剂能够实现蛋白质间的良好分离,是提高双向电泳分离效果的一个有力措施。, 离液剂 尿素是常用的离液剂,它的主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构,使得蛋白变性并使蛋白酶失活。尿素作为一种中性的离液剂,通常在裂解液中的浓度为8mol/L。尿素可溶解和解折叠大多数的蛋白质,形成完全随机的构象,使所有的离子基团暴露于溶液中。近来硫脲的加入可以
16、进一步提高溶解度,特别是膜蛋白。在实际应用中,需要高溶解强度时,一般用2mol/L硫脲和5-8mol/L的尿素联合使用。,., 还原剂 还原剂主要是用来断裂蛋白分子中Cys残基之间形成的二硫键,增加蛋白的溶解性。通常用的还原剂有-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)或二硫赤藓糖醇(DTE)和三丁基膦(TBP),目前常用的是DTT。,., 去污剂(表面活性剂) 去污剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作用,以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。去污剂有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。经常使用的有阴离子去污剂SDS,非离子去污剂NP-40和TritonX-100,两性离子去污剂CHAPS。原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型,这样才不会影响蛋白质的迁移位置。最初,两个相似的非离子去污剂NP-40和Tr