《十一次目基因PCR扩增与检测学习资料》由会员分享，可在线阅读，更多相关《十一次目基因PCR扩增与检测学习资料（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分子生物学实验,实验十一 目的基因的PCR扩增与检测,一、 实验目的： 熟悉PCR方法体外扩增DNA的基本原理，掌握PCR技术的常规操作，了解PCR引物及参数的设计。利用PCR扩增的方法获取用于表达的目的基因（CYP6B6）。 二、 实验原理： PCR扩增是一种类似于DNA的天然复制过程，以待增的DNA为模板、在体外由引物介导的酶促合成特异性DNA片段的方法。,PCR方法体外扩增DNA的基本原理图示,（1）引物长度应为1530个核苷酸，Tm可按下列简单公式计算： Tm=（G+C）x 4 +（A+T）+35- 2n （2）引物中碱基的分布应当是随机的，避免出现一连串的单一碱基或产生二级结构。 （
2、3） G+C碱基的含量在45%55 %左右。 （4）两个引物在3 端均必须与模板互补，5端可以不互补。 （5）引物自身连续互补碱基小于4个。 （6）引物之间连续互补碱基亦应小于4。,引物设计的一般原则,设计和选择高效而且特异性好的引物是PCR的关键,循环参数： 变性（denaturation） 变性是高温短时， 94C ，30s-1min。同时在第一轮循环前先进行94预变性5min，以便使模板DNA完全解链。 退火（annealing） 实际使用的退火温度要比引物的Tm低5 。 退火温度在5572 之间都会得到好的结果。 延伸（extension） 一般引物延伸是在72 下进行。对2Kb长的产
3、品扩增时间多采用1min。 循环次数（cycle） 一般为30个循环，如果循环次数过多会增加非特异性产物的量。,1、,55 *,1. 取一个0.2ml eppendorf管，添加以下各种成分反应液 ddH2O 12.1 l 模板DNA 0.5 l（20-40ng）原质粒进行1：20倍稀释 上游引物(100mol/L) 0.3l 下游引物(100mol/L) 0.3 l dNTP mixture(10mmol/L) 2 l 10倍缓冲液 2.5l Taq酶 0.4l 总体积 20 l 2. 稍作离心，将反应管放入PCR仪中。,2、 反应体系: (CYP6B6),3. 设定反应程序： 94条件下使模板DNA预变性5min。 变性 94 30s 退火 55 45s 30 cycles 延伸 72 90s 最后在72条件进行延伸7min。 4 保温 4. 取8 l反应液用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳，鉴定PCR产物是否存在以及大小。,
