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1、食品安全的生物技术检测,生吉萍,资料整理:KLC净化设备/KLC空气过滤器 ,一、转基因生物的特性,1、由启动子、结构基因和终止子组成的基因盒（gene cassette）。 2、抗性筛选标记基因和报告基因,重组质粒基因包括：,标记片段,启动子,目的基因,终止子,载 体 基 因 片 段,3、检测目标,在检测转基因食品时，主要针对外源启动子、终止子、筛选标记基因、报告基因和结构基因的DNA序列和产物进行检测。,4、检测的方式,基于核酸的PCR检测技术 基于蛋白质的酶学和免疫学检测技术 向自动化技术发展的生物传感器 生物芯片技术。,二、PCR检测技术,1、策略： 针对外源的序列进行检测 ，如：Ca
2、MV35S启动子，和NOS终止子，抗性筛选标记基因和报告基因。,2、优点,可以从加工过的食品中检测出外源基因，并且具有操作相对简单的特点，因此成为目前应用最为广泛的检测方法。,表 PCR检测植物源转基因食品目的DNA所用引物 靶基因 引物序列 产物长度（bp） NPT TGCGGCCGCTTGGGTGGAGAG 470 CTGGCGCGAGCCCCTGATGCT CAT TCTTGCCCGCCTGATGAATGCTC 471 GCCCCGCCCTGCCACTC HPT AGCTGCGCCGATGGTTTCTACAA 509 ATCGCCTCGCTCCAGTCAATG GUS CTGCGACGC
3、TCACACCGATACC 441 TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG NOS终止子 AGAAGGAGTGCGTCGAAGCA 178 AATCATAAAAACCCATCTCA OCS终止子 ATCAAATCTTCCAGCTTTAA 185 CAATCAGTAAATTGAACGGA CaMV终止子 CGCAAATCACCAGTCTCTCT 201 ACTGGATTTTGGTTTTAGGA BAR GCCGACATCCGCCGTGCCAC 479 GTCCAGCTGCCAGAAACCCA BARNASE CTGGGTGGCATCAAAAGGGAACC 160 TCCGGTCTGAA
4、TTTCTGAAGCCTG BARSTAR TCAGAAGTATCAGCGACCTCCACC 235 AAGTATGATGGTGATGTCGCAGCC Camv35S GCTCCTACAAATGCCATCA 195 启动子 GATAGTTGGGATTGTGCGTCA,3、 PCR技术,普通PCR技术 巢式PCR技术 多重PCR技术 PCR-ELISA技术 定量PCR技术 real-time 实时定量PCR技术等。,1）普通PCR反应,*是目前应用最为广泛的技术，是其他PCR技术的基础。 *通过对要扩增的目标DNA序列设计特异引物（或简并引物），优化反应条件，达到对目标序列扩增的目的。 *普通P
5、CR广泛应用于分子生物学研究的各个领域。如病原菌的检测、转基因生物的检测、疾病的检测、基因的克隆、基因工程载体的构建等。,2）巢式、半巢式PCR技术,是消除假阴性、假阳性提高灵敏度的方法。,巢式PCR技术,设计两对引物，其中一对引物结合的位点在另一对引物扩增的产物之中。,具体过程： 首先运行扩增大片段的引物，然后以第一次扩增的产物作为模板，进行第二次扩增，这样通过产物的琼脂糖凝胶电泳比较就可以知道检测结果。,如果第一次扩增是非特异的，而且扩增的片断大小与设计的相似，在电泳中无法区别，这时通过第二次扩增，由于第二对引物与扩增产物中没有配对的序列，因此不能扩增出产物。这样就消除了假阳性的干扰。 同
6、时，由于第一次扩增起到模板数量放大的作用，使检测的灵敏度增加了3-6个数量级，使检测的低限达到pg乃至fg级。,3）多重PCR技术,即设计一组引物，在一个PCR反应过程中，对多个目的片断进行扩增。 特性：包括内部对照、指示模板数量和质量、消耗的时间和试剂少，使得多重PCR技术已发展成为一种通用的技术。,应用,在病原体检测、性别筛选、连锁分析、法医研究、模板定量和遗传疾病诊断等。在对细菌的PCR分析中，应用多重PCR技术非常有优越性，可以区分同一属中的种和株，这样我们就检测出在同一属病原菌中，是否有对人体有害的病原菌或产毒菌。 目前，已有利用多重PCR技术检测Salmonella、Escheri
7、chia coli、Listeria 等食品有害菌。,4）PCR-ELISA技术,指用ELISA技术检测PCR的产物。 在PCR反应体系中加入生物素标记的dUTP和其他3种dNTP，这样在扩增反应中生物素标记的核苷酸就会掺入到新合成的DNA链中去，经过电泳或过柱除去游离的dNTP、引物和引物二聚体后，用3端经DIG标记的特异探针与之结合，然后加到包被有抗生素抗体的酶标板上，此后，用ELISA法进行定性或定量分析。,4、酶学检测技术,目前在基因工程中应用的报告基因和抗性筛选标记基因都是编码某一种酶。 主要有：卡那霉素抗性标记基因（Npt）、-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）、氯霉素乙酰转移酶基因（Ca
8、t）、胭脂碱合成酶基因（Nos）、章鱼碱合成酶基因（Oct）等。,特点,酶学检测方法一般适用于对鲜活组织的检测和对接受基因工程改造生物体的初步检测。 目前在许多情况下，国外一些公司可以通过一些技术手段删除抗性筛选标记基因，因此用酶学检测转基因食品原料，在应用中有一定的局限性。,1）GUS基因的检测,GUS基因存在于某些细菌体内，编码-葡萄糖苷酸酶（-glucuronidase，GUS）。 是一种水解酶，可以催化许多-葡萄糖苷酯类的化合物水解。,特性,该酶在表现活性时不需要辅酶，最适pH范围较宽为5.28.0，同时也适应较宽的离子浓度。 该酶的专一性较差，-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）、4-甲基
9、伞形酮酰-D-葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG）和对硝基苯-D-葡萄糖醛酸苷（PNPG）都可以作为底物。,常用方法：,a）组织化学染色定位法； b）荧光光度法测定Gus活性； c）分光光度法测定Gus的活性,2）Cat基因的检测,Cat基因编码氯霉素乙酰转移酶。 催化乙酰COA上的乙酰基转向氯霉素生成1-乙酰氯霉素、3-乙酰氯霉素、1，3-二乙酰氯霉素。乙酰化的氯霉素不再具有氯霉素的活性，失去了干扰蛋白质的作用。 真核细胞不含Cat基因，无该酶的内源活性，转化Cat基因的细胞可以产生对氯霉素的抗性，并可通过检测转化细胞中Cat活性来了解是否是转基因生物。,检测,Cat的活性通过反应底物乙酰CoA的减
10、少或反应产物乙酰化氯霉素及还原型CoASH的生成来测定。 目前常用的方法有硅胶G薄层层析法及DTNB分光光度法。,3）冠瘿碱合成酶基因的检测,冠瘿碱合成酶基因存在于农杆菌Ti质粒或Ri质粒上，该基因与Ti质粒的致瘤作用无关，该基因的启动子是真核性的，在农杆菌中并不表达，整合到植物染色体上后就可以表达。,冠瘿碱合成酶有两种：,一种是胭脂碱合成酶（nopaline synthase），催化冠瘿碱的前体物质精氨酸与-酮戊二酸进行缩合反应，生成胭脂碱。 精氨酸 + -酮戊二酸 + NADH 胭脂碱 + NAD+ 另一种是章鱼碱合成酶,催化精氨酸与丙氨酸缩合而成。. 精氨酸 + 丙酮酸 + NADH 章
11、鱼碱 + NAD+,检测,植物细胞中胭脂碱的检出,目前主要采取Otten的方法。,Otten法,原理是利用纸电泳分离被检组织的抽提物，然后用菲醌染色。 因为菲醌是胍基类化合物的特异性染色剂，与精氨酸、胭脂碱、章鱼碱作用后在紫外光下显示黄色荧光，放置两天后变成兰色。,4）Npt基因的检测,该基因来源于细菌转座子Tn5上的aphA2，编码氨基糖苷-3-磷酸转移酶，使氨基糖苷类抗生素（新霉素、卡那霉素、庆大霉素等）磷酸化而失活。 使用了Npt基因转化植物可以使植物细胞产生对氨基糖苷类抗生素的抗性，因此，是一个有效的选择标记基因； 该酶可以通过反应检测其表达，因而又是一个常用的报告基因。,检测原理,利
12、用放射性标记同位素-32PATP，通过-32P基团转移，生成带放射性的磷酸卡那霉素，通过点渍法、层析法、凝胶原位检测法对放射性-32P进行定量分析检测。,5） Pat基因检测,Pat基因编码抗除草剂PPT的乙酰转移酶（PAT）。 除草剂PPT是一种谷氨酸结构的类似物，可以竞争性的抑制谷氨酰氨合成酶（GS）的活性，使细胞内的NH4+积累而中毒死亡。,Pat编码的PPT乙酰转移酶（PAT）可以催化乙酰CoA分子上的乙酰基转移到游离氨基上，使PPT乙酰化失去对GS的抑制作用，而表现出抗性。,检测,Pat基因有Bar基因和Pat基因两种，分别来源于Streptomyces hygrocopicus和S
13、.Viridochrgtnes。 bar基因可以作为筛选转化体的标记基因，也可以因为检测方法灵敏作为报告基因。 目前对pat基因的检测方法有硅胶G薄层层析法及DTNB分光光度法。,2、免疫学检测技术,在转基因食品的检测中，运用最多的是双抗夹心ELISA检测技术。,应用,利用双抗夹心ELISA已对卡那霉素抗性基因Npt，Bt内毒素基因Cry1A、Cry2A、Cry3A、Cry9C，草甘膦抗性基因CP4-EPSPS、mEPSPS，GOX基因、GUS基因等产物进行了检测和安全性评价。,但是用ELISA不能对加工过的食品进行检测。因为在加工过的食品中，抗原蛋白质发生了变性，不能被抗体所识别，因此在利用上有其局限性。,Thank You,
