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1、限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是提高自身的防御能力. 限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。,根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。,第一型限制酶
2、同时具有修饰（modification）及识别切割（restriction）的作用；另有识别（recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位点（cleavage site）距离识别位点（recognition site）可达数千个碱基之远。例如：EcoB、EcoK。 第二型限制酶 只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文序列（palindrome sequence）；所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、Hind。 第三型限制酶 与第一型限制酶类似，同时具有修饰及识别切割的作用。可识别短的不对称序
3、列，切割位与识别序列约距24-26个碱基对。例如：Hinf。,生理意义,限制作用实际就是限制酶降解外源DNA1 ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保护。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。所以，能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中可能有该酶识别的序列，只是该识别序列或酶切位点被甲基化了。但并不是说一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多数限制酶对DNA甲基化敏感，因此当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时，对酶切的影响有3种可能，即不影响、部分影响、完全阻止。对甲基化DNA的切割能力是限制酶内在和不可预测的特性
4、，因此，为有效的切割DNA，必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感性。另外，大部分商业限制酶如今专门用于切割甲基化DNA。,限制性内切酶的应用,自从I型限制酶发现以来,越来越多地受到生化学家的青睐,因为限制酶对DNA分子具有专一性的切口,而为人们在分子水平上切割分析、重组遗传信息提供了重要的工具。 (一)用于染色体DNA的分析 先将DNA用限制性内切酶切割成一系列片段,利用聚丙烯酷胺或琼脂糖电泳可以轻而易举地将上述片段分离并且通过测定它们在凝胶中的迁移速度或直接在电镜下观察测量它们的大小。这些碎片在整个基因组的排列次序,主要靠几种不同的限制酶部分水解DNA,再对产物进行电泳分析。
5、,用同样的方法也可以进行DNA中各脱氧核普酸的顺序分析。也就是说,逐步使用多种限制酶,可将染色体DNA片段切得很小,如果片段之间出现重迭,分析小的重迭DNA片段的脱氧核普酸的序列,用现在的生化方法是毫无问题的。 (二)确定DNA复制起点或终点的位置在DNA复制开始之后,将DNA分离出来,用限制酶处理,再用电镜观察是在什么地方开始复制的,Fareed等利用EeoRI确定了sV40DNA分子的复制起点。 同理也可以确定RNA在DNA上的转录位置,例如,将标记的RNA与未标记的DNA杂交,就可以知道这段RNA是从哪一段DNA上转录的。,(三)基因的甲基化研究 由于HPal仅能识别切割双链DNA分子中
6、ccGG顺序,但其中Cyt必需是设有甲基化的;而MPsI识别同样的顺序,但其中Cyt必需是被甲基化的。因此有人利用这一对限制酶对真核基因的甲基化程度进行研究(1。 (四）应用于DNA重组 分子生物学研究中发现的许多核酸酶类都可用作基因工程的工具。其中能识别特定的回文序列并切割DNA双链的类限制性核酸内切酶在DNA重组技术中被广泛应用。 （五）构建载体 采用5端引入1个限制性内切酶Xcm 酶切位点的1对引物,以水稻品种日本晴基凶组DNA作为模板,扩增得到一段627 bp的PCR片段.并将其连接到pGEM-T Easy载体上得到名为T-xia的重组载体.利用限制性内切酶Xcm 酶切T-xia载体产
7、生的自制T载体与其他PCR片段连接,检测结果表明,有80%的重组菌能扩增出目的片段。,限制酶的作用位点,质粒,质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体（Vector）。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。其自我复制能力及所携带的遗传信息在重组DNA操作，如扩增、筛选过程中都是极为有用的。,质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相
8、比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：分子量小、多拷贝、松弛控制型；具有多种常用的限制性内切酶的单切点；能插入较大的外源DNA片段；具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和筛选。对宿主细胞无害。常用的质粒载体大小一般在1kb
9、至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。,细胞复制,质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制型（Stringent control）和松弛控制型（Relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如 Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷
10、贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。,质粒的不相容性,利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时, 它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争。在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。质粒通常含有编码某些酶的基因，其表型包括对抗生素的抗性，产生某些抗生素，降解
11、复杂有机物，产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。,质粒图谱,大肠杆菌质粒的分子结构示意图,pBR322质粒,pBR322质粒DNA分子的长度为4361bp*（*Sequencing data from Watson (confirmed at New England Biolabs, Inc.) has shown pBR322 to be 4,361 base pairs, not 4,363 base pairs as previously reported.），此载体中有两个标记基因，一个是氨苄青霉素抗性基因（Apr），另一个是四环素抗性基因（Tetr）。已知pBR322
12、DNA分子共有24种核酸内切限制酶的单一识别位点。其中7种限制酶（从12：00位置按顺时针方向）即EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、Xma和NruI的识别位点位于四环素抗性基因内部，另外有2 种限制酶即ClaI和Hind的识别位点是存在于这个基因的启动区内，在这9个限制位点上插入外源DNA都会导致tetr的失活。3种限制酶即ScaI、PvuI和PstI的识别位点位于氨苄青霉素抗性基因内，在这些位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。,由pBR322质粒载体的结构可知其具有如下优点：具有较小的分子量。经验表明，为了避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂，克隆载体的分子大小
13、最好不要超过10Kb。pBR322质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段；具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。标记基因往往可以赋予宿主细胞一种新的表型，这种转化细胞可明显地区别于非转化细胞。当我们把一个DNA片段插入到某一个标记基因内时，该基因就失去了相应的功能。当把这种重组DNA分子转到宿主细胞后，该基因原来赋予的表型也就消失了。要是仍保留了原来表型的转化细胞，细胞内含有的DNA分子一定不是重组子。很显然，既要指示外源DNA是否进入了宿主细胞，又要指示
14、载体DNA分子中是否插入了外源DNA片段，那么这种载体必须至少具有两个标记基因。另外，pBR322质粒载体还具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可积累10003000个拷贝，这就为重组体DNA的制备提供了极大的方便。,常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因（Tcr）和抗氨苄青霉素基因（Apr），并含有27种限制性内切酶的单一识别位点。 pBR322质粒作为一种常用的基因克隆载体，在实际应用中有着非常重要的地位，其中一个突出的例子就是应用pBR322 作为克隆载体对水稻的叶绿体光诱导基因psbA 进行结构分析。,应用实例 -1,将水稻叶绿体的
15、DNA，用EcoRI核酸限制性内切酶消化之后，放入含有溴化乙锭的低熔点（LMP）的1%琼脂糖凝胶中作电泳分离。从LMP中分离出分子大小为1.82.5kb之间的DNA片段，再与同样经过了EcoRI核酸限制性内切酶切割并用碱性磷酸酶作了脱磷酸处理的pBR322质粒连接。然后，将混合物转化到大肠杆菌5346菌株，培养在氨苄青霉素选择平板上，形成Ampr转化子菌落群体。这样就构成了由EcoRI核酸限制性内切酶切割的水稻叶绿体DNA基因组库。用Ampr转化子菌落与32P放射性标记的玉米psbA DNA 探针作菌落杂交，可以分离出其中的阳性克隆体。从这些阳性克隆体中分离出来的重组体质粒DNA，经过进一步的
16、分析，就能测出水稻叶绿体基因psbA的序列。,应用实例-2,利用pBR322作为载体重组人体的抑生长激素也是一个经常提到的应用例子。其过程和水稻叶绿体基因重组大同小异，只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因外，还将含有lac操纵子起始部分的片段（包括启动子、操纵区、核糖体结合位点和半乳糖苷酶的主要部分）插在抑生长激素基因的旁边。由于有了lac操纵子的控制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了。,应用实例-3,目的监控MSAP甲基化检测过程,以控制MSAP每一反应步骤。方法利用PBR322质粒作为阳性对照,全程监控MSAP分析中酶切、连接、预扩与选扩体系。结果PBR322质粒作为阳性对照电泳时条带有限,可以根据条带有无和位置对MSAP甲基化检测过程进行全程监控,有助于发现问题的具有所在。结论该研究可以为MSAP技术提供可靠保障。 MSAP-甲基化敏感多态性扩增技术,参考文献,1. 陈维辛，孙欣. 限制性内切酶及其应用.生化药物杂志,1989. 2.吴娜.DNA重组及基因工程技术的应用现状,2013（13）. 3.夏志辉，董军美，罗越华.利用限制性内切酶Xcm 构
