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1、限制性核酸内切酶,演讲者：王凯,II型限制酶,限制酶的定义,1,限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。限制酶在基因工程中广为使用。,限制性核酸内切酶分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶。细菌通过自身的限制酶，破坏入侵的外源DNA，从而保护自身。,30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR
2、II，以及来源于流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。,限制酶的发现,命名,EcoR I,Escherichia,属名,Coli,种名,Ry13,株系,编号,切割频率,切割频率是指某限制性核酸内切酶在DNA分子中预期的切割概率。可以估算该限制性核酸内切酶在某种DNA分子中的切点数。 前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、碱基排列在DNA分子上是随机分布的。这样每个位点上，每一种碱基出现的概率即为1/4 。 如果某限制性核酸内切酶的识别序列是6 bp，则其切割频率为(1/4)6 =1
3、/4096，即每隔4.1kb就可能有一个切割点。当识别序列为n个 bp， 则其切割频率为（1/4）n 。,限制酶的种类,2,I型限制酶 通常其切割位点与识别位点相距千个碱基, 不能准确定位切割位点。例如：EcoB、EcoK。 II型限制酶 所识别的序列多为短的回文序列，切割位点与识别位点一致。是基因工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。 III型限制酶 切割位点与识别位点相距24-26个碱基，不能准确定位切割位点。例如：EcoPI、HinfIII。,什么是回文序列？,GAATTAAG C TTAATTC,GAATATTC CTTATAAG,II型限制酶,ApaI 识
4、别序列： 5GGGCCC 3 BamHI 识别序列：5 GGATCC 3 BglII 识别序列： 5 AGATCT 3 EcoRI 识别序列： 5 GAATTC 3 HindIII 识别序列： 5 AAGCTT 3 KpnI 识别序列： 5 GGTACC 3 NcoI 识别序列： 5 CCATGG 3 NdeI 识别序列： 5 CATATG 3 NheI 识别序列： 5 GCTAGC 3 NotI 识别序列： 5 GCGGCCGC 3 SacI 识别序列： 5 GAGCTC 3 SalI 识别序列： 5 GTCGAC 3 SphI 识别序列： 5 GCATGC 3 XbaI 识别序列： 5 T
5、CTAGA 3 XhoI 识别序列： 5 CTCGAG 3,II型限制酶切割DNA后形成粘性末端或平末端分别由错位切和平切形成。能形成粘性末端的酶在基因工程中应用最多。,粘性末端和平末端,5NNNGTTAACNNN3 3NNNCAATTGNNN5,5NNNGTT AACNNN3 3NNNCAA TTGNNN5,5NNNGCGGCCGC NNN3 3NNNCGCCGGCGNNN 5 ,5NNNGC GGCCGC NNN3 3NNNCGCCGG CGNNN5 ,Hae的识别序列,Not 的识别序列,5粘性末端和3粘性末端,5NNGCGGCCGC NN3 3NNCGCCGGCGNN 5 ,5NNNG
6、C-OH P-GGCCGC NNN3 3NNNCGCCGG-P HO-CGNNN5 ,5粘性末端,3粘性末端,5NNGGTACCNN3 3NNCCATGGNN 5 ,5NNGGTAC-OH P-CNN3 3NNC-P HO-CATGGNN 5 ,同尾酶,切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH I,Bcl I,5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl ,5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5,Xho ,同裂酶,有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这
7、类酶称为同裂酶。识别序列和切割位点都相同的叫同序同切酶，识别序列相同但切割位点不同的叫同序异切酶。 例如：Hpa和MspI为同序同裂酶（CCGG）。XmaI和SmaI为同序异裂酶，都识别CCCGGG，但Xma I的切点在CCCGGG，形成带有CCGG的粘性末端；而Sma I的切点则在CCCGGG，形成平末端。,有些限制酶识别的序列不是回文序列。 Acc 的识别切割位点分别是GTAGAC 和 GTCTAC BbvC 的识别切割位点分别为CCTCAGC和GGAGTCG,特殊的II型限制酶,GTATCGAC CATAGCTG,CCTCAGC GGAGTCG,1) DNA的纯度 2) DNA的甲基化程
8、度 3) 酶切消化反应的温度 4) DNA的分子结构 5) 限制性核酸内切酶的缓冲液 6) Star活性（星活性）,影响限制性酶活性的因素,限制酶消化DNA底物的反应效率，很大程度上取决于所使用的DNA的纯度。DNA制剂中的含有蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高浓度的盐离子等都有可能抑制限制酶的活性。,提高限制酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用三种方法： 增加限制酶的用量。 扩大酶催化反应的体积。（以使潜在的抑制因素被相应地稀释） 延长酶催化反应的保温时间。,DNA的纯度,DNA的甲基化程度,识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，会严重影响酶的催化效率。 为避免这样的问题，在基因克隆
9、中使用的质粒DNA是从失去甲基化酶的大肠杆菌菌株中提取的。,酶切消化反应的温度,不同的限制酶具有不同的最适反应温度。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度是37，有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的37，SmaI是25、ApaI是30；有些高于标准的37，例如MaeI是45、BclI是50、MaelII是55。,DNA的分子结构,DNA分子的不同构型对限制酶的催化效率也有很大的影响。某些限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。,核酸内切限制酶的缓冲液,II型限制酶的最适pH一般是6-8, 缓冲液中通常含有Mg2+。,Star活性
10、（星活性）,限制酶在一些特定条件下使用时，识别位点的特异性降低，可以把不同于正常识别的序列切断，这个现象叫Star活性。Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同。,Star活性主要受低粒子强度、高pH值以及过高的甘油浓度的影响。,消化DNA样品后，需要钝化内切酶的活性，终止反应。 方法： 1）65温浴5-10分钟，使酶失活。 2）加入EDTA除去酶分子的镁离子，是使酶失活。 3）加SDS或者尿素使酶解聚沉淀。 4）用等体积的酚抽提酶解产物，提取DNA。,限制性内切酶反应的终止,限制性内切酶的保存,限制酶于-20用50的甘油保存。,基因工程中常用的工具酶有限制酶、DNA聚
11、合酶、DNA连接酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端转移酶、甲基化酶。,型限制酶在基因工程中的的应用,3,将目的基因导入受体细胞前，需要用相同的限制酶将目的基因和载体切成相同的粘性末端，再通过碱基互补配对的方式，在连接酶的作用下，目的基因和载体完成连接。最后将连接好的重组载体导入细胞。,双酶切法,AGCTTNN NNG ANN NNCCTAG,为什么通常要用两种限制酶？,可以有效防止载体自连造成空载体。,连接酶,可不可以用一种酶切割目的基因和载体？,可以，此时切割后的载体需要加入碱性磷酸酶处理。碱性磷酸酶可以去除酶切后切口的磷酸，从而使粘性末端在加入连接酶后不能重新结合。,5NNNGCGGCCGC
12、NNN3 3NNNCGCCGGCGNNN 5 ,5NNNGC-OH p-GGCCGC NNN3 3NNNCGCCGG-p HO-CGNNN5 ,5NNNGC -OH GGCCGC NNN3 3NNNCGCCGG HO-CGNNN5 ,碱性磷酸酯酶,单酶切法,pAGCTTNN NNA-OH HO-ANN NNTTCGAp,DNA连接酶,基因工程中，很多情况下，基因组中靠近目的基因两侧的碱基并没有合适的酶切位点。怎么办？,Hsp70A ：Ex-F 5 CGCCATATGCCAGCTATCGGAATCGATTTGG 3 Nde I Hsp70A ：Ex-R 5 GCGGCCGCATAAAGGTGGG
13、GAGAGCTTACAAC3 Not I,通常是设计合适的PCR引物，让目的基因在PCR扩增后，两侧含有酶切位点。,DNA甲基化酶,4,甲基化酶：可以从活性甲基化合物(如S-腺苷甲硫氨酸)上将其甲基转移到其他化合物的酶。可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。,DNA甲基化酶：以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到DNA特定的碱基上的过程。,原核生物的甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。,Dam甲基化酶在 GATC 序列中的腺嘌呤上引入甲基。一些限制酶（如BamH、Bcl、Sau3A等）的识别位点中含 GAT
14、C 序列。 有些限制酶对Dam甲基化的DNA 敏感，不能切割相应的序列，如 Bcl。有些限制酶对Dam甲基化的DNA不敏感，如 BamH、Sau3A等。,甲基化酶对限制酶的影响： 1.修饰酶切位点。 构建 DNA 文库时，用 Alu（AGCT） 和 Hae（GGCC） 部分消化基因组 DNA 后，将得到的片段用 M.EcoR甲基化酶处理，然后加上合成的 EcoR 接头，再用 EcoR来切割时只有接头上的位点可被切割，从而保护基因组片段。 2.产生新的酶切位点 有些酶只识别经过甲基化的序列。Dpn 是依赖甲基化的限制酶， TCGATCGA 受 M.Taq 处理后形成甲基化(A)产物 TCG*ATCG*A ，其中 G*ATC 即为 Dpn 位点。,谢谢观看,
