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1、海洋生物活性肽研究进展海洋生物物种的多样性以及所含化合物的特异性，为海洋生物资源的开发利用提供了许多机遇与挑战。由于海洋存在许多极端环境，如高压（深海）、低温（极地、深海）、高温（海底火山口）和高盐等。为了适应这些极端的海洋生境，海洋生物蛋白质无论氨基酸的组成或序列都与陆地生物蛋白有很大的不同。生物活性肽是指那些有特殊生理活性的肽类。同时，海洋生物蛋白资源无论在种类还是在数量上都远远大于陆地蛋白资源，并且未得到很好的开发。1海洋天然生物活性肽天然存在的活性肽包括肽类抗生素、激素等生物体的次级代谢产物以及各种组织系统，如骨骼、肌肉、免疫、消化、中枢神经系统中存在的活性肽。随着人们对海洋资源认识水
2、平的提高，以及现代生物技术在海洋药物研究中的应用，RP-HPLC,2D-NMR,TOF- MS,手性色谱（包括GC, HPLC)等技术的发展，使得对海洋活性肽的研究易于进行。目前研究的海洋活性肽主要包括来源于海鞘、海葵、海绵、芋螺、海星、海兔、海藻、鱼类、贝类等的活性肽以及在海洋生物中广泛分布的生物防御素。1.1海鞘多肽 海鞘(Ascidian)属于脊索动物门，海鞘纲与尾索动物亚门的另外两个纲称为被囊动物（Tunicate），约有2000种，海鞘是被囊动物中种类最丰富、含有重要生物活性物质最多的一类。自1980年Ireland等从海鞘中发现一个具有抗肿瘤活性的环肽Ulithiacycla- m
3、ide以来，不断有环肽从此类海洋生物中发现。最令人瞩目的是从加利福尼亚海域及加勒比海中群体海鞘Trididemnum solidum. 中分离出的3种环肽Didemnin AC,它们都具有体内和体外抗病毒和抗肿瘤活性，其中Didemnin B的活性最强，对乳腺癌、卵巢癌具明显的抑制活性。同时，它还有明显的免疫抑制活性，体内活性较环抱霉素A强 1000倍，有望成为新型抗肿瘤药1.2海葵多肽海葵(Anemone)是另一类富含生物活性物质的海洋生物。文献报道从海洋生物海葵中提取得到的溶细胞性活性肽可分为3类： (1)存在于16种海葵中的鞘磷脂抑制性碱性多肽，平均相对分子质量在1500021000之间
4、。（2）从Metridrum senile属海葵中分离得到的具胆固醉抑制活性肽，其平均相对分子质量在80000左右。（3）从Aiptasu palli- da属海葵中分离提取的、活性未知的Aipta- siolysin A多肽。1.3海绵多肽 海绵(Sponge)是最低等的多细胞动物，结构较简单，但作为一个特殊生物群体含有极丰富的生物活性物质。富含活性多肽的海绵包括离海绵目、外射海绵目、石海绵目、软海绵目、硬海绵目。Jaspamide是从斐济和几内亚海域离海绵目Jaspis属海绵中分离得到的环肽。实验证明该肽具有杀伤线虫活性和细胞毒活性，其结构的全合成已经完成。 Geodiamolides A
5、,B是从加勒比海离海绵目 Geodia sp.属海绵中分离得到的环肽成分。具有细胞毒活性，利用NMR和X-射线晶体衍射分析已确定其化学结构。Celenamides AD是从东太平洋硬海绵目中分离得到的具乙酞化的小肽，体外实验证明具有降低血色素的作用。1.4芋螺多肽芋螺(Conus)是海洋腹足纲软体动物，其在猎取鱼、海洋蠕虫、软体动物时常分泌一系列毒性物质，称为芋螺毒素(Conotoxin)。经过近20年的研究已发现的芋螺毒素有近百种，主要包括-芋螺毒素、-芋螺毒素、- 芋螺毒素、-芋螺毒素。大多为由1030个氨基酸残基组成的小肽，富含2对或3对二硫键，是迄今发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽，
6、也是二硫键密度最高的小肽。其活性与蛇毒、蝎毒等动物神经毒素相似，可引起动物出现惊厥、颤抖及麻痹等症状。1.5海星多肽从烫灼或自主运动的一种海星所分泌的体液中分离纯化到一种自主刺激因子。凝胶电泳分析表明该肽的相对分子质量为1200, HPLC检测为单峰组分。具有刺激细胞运动并使之产生应激反应的功能。1.6海兔多肽从印度海兔(Dolabella auricularia)中分离到10种细胞毒性环肽Dollabilatin 1 10。其中Dollabilatinl0对B16黑色素瘤治疗剂量仅为1.1gmL-1，是目前已知活性最强的抗肿瘤化合物之一。1.7海藻多肽海藻(Alga)种类繁多，其中含有的生物
7、活性物质也多种多样。从培养的蓝藻中分离出一种具有鱼毒性、抗菌、杀细胞活性的生物活性肽，已具备大规模生产能力。Hor- mothamin是从海藻Prymnesium patellife- rum中提取的毒素肽，具有溶细胞、细胞毒和神经毒等活性，其作用机制主要是影响脑垂体细胞静止期的钙离子通道、提高电压敏感性钙离子通道的释放，促进脑内激素如催乳素的分泌增加而产生作用。从海藻Lyngb- ya majuscula中分离到一具有细胞毒活性的环肽majusculamide C,它对X5536骨髓瘤细胞的抑制效果达到35。1.8鱼类多肽鱼类是人们最早食用的海洋生物之一，其体内含有丰富的蛋白质成分，营养价值
8、相当高。但从其中开发具有药用价值的活性物质的研究却较少。曾有报道从铜吻蓝鳃太阳鱼中分离并鉴定出4种具缓激肽活性的肽类，对鱼肠组织细胞具有强烈的刺激作用。还有研究从大西洋鳕鱼（Gadus morhua）、虹蹲(Ondorhyridus mykis)、欧洲鳗鲡(An- guilla anguilla)等鱼类的嗜铬细胞组织中提取到一系列的生物活性肽及其类似物，并利用免疫组织化学方法研究其在细胞组织中的作用，发现此类肽与肾上腺素受体具有一定的亲合性，可能具有控制儿茶酚类物质释放的作用。 1.9贝类多欣 从海洋贝类的神经元中提取到2种神经肽Pd5和Pd6,它们具有促进神经元产生的活性。利用HPLC方法纯
9、化并对其氨基酸序列进行了分析。现已完成其结构的全合成。 1.10生物防御素 生物防御素(Defensin)是近年来发现的一组新型抗菌活性肽。它们通常都是由35 50个氨基酸残基组成，且分子内富含二硫键。由于其具有牢固的分子骨架、广泛的分布以及生物活性功能，因而对它们的研究已成为当前国际学术界中一个引人关注的研究热点。各类抗菌防御素不但在结构上具有相应的保守序列和相似的紧密空间构型，在功能上也都有相似的共性如抗菌、抗病毒能力和细胞毒性作用等。无论-、-防御素对革兰阳性和阴性细菌都具有杀伤作用。相对而言，它们对革兰阳性细菌，显示了更强的杀伤能力，而植物防御素被认为是真菌生长的有效抑制剂。许多-防御
10、素如NPI2，HNPI 3等已被验证了对病毒的杀伤作用。各类防御素除具有上述抗菌和抗病毒功效外，对自身细胞似乎也有侵害作用，如已有实验表明多形核细胞可释放某种细胞侵害因子，该因子的产生和作用似乎与多形核细胞胞内防御素的含量成正比关系。此外某些防御素还能杀死肿瘤细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞和内皮细胞等。其杀伤能力呈现浓度和时间依赖性，通常最适浓度为25l00gmL-1，作用6h达到最大效力。 大量的研究资料表明，防御素与其他类型抗菌肽作用机制相似，它们主要是通过在细胞膜上形成通道，引起细胞离子通道性的失衡和胞内物质的泄漏、进而导致细胞活动的异常。防御素在细胞膜上的通道形成过程与膜的磷脂组成成分和
11、所处的温度环境等因素有关。然而，一旦防御素在膜上形成了通道，上述因素便不会对其通道的活动构成本质的影响。 生物防御素的抗菌、抗病毒及其杀伤肿瘤细胞的多重功能效应无疑正展示着它们对物种生存、抵御侵害以及提高人的生活质量等实际应用中的显要身价。另一诱人的前景是，这些防御素由于分子小并具有稳定的分子结构等优点，又为当今研制多肽新药提供了理想的分子设计骨架和模板。 2 海洋酶解生物活性肽 天然存在的活性肽大部分或含量微少，或提取难，不足以大量生产供给所需；化学人工合成又费时费力，成本昂贵；因此，人们更多地把目光投向开发蛋白酶解产物这条途径上来。 2.1 水解营养蛋白生产生物活性肽的理论基础 过去，人们
12、一直未对利用贮藏蛋白，如花生、大豆、小麦等种子蛋白等和动物营养蛋白如乳蛋白水解制备生物活性肽给予应有的重视，但是现在科学家逐渐注意到：在营养蛋白的多肽链内部可能普遍存在着功能区，选择适当的蛋白酶水解，这些多肽有可能被释放出来，从而制备各种各样的生物活性肽。 从生物进化上看，营养和贮藏蛋白应该是从功能蛋白进化而来的，因为原始的生物是不可能合成大量此类蛋白的。当生物进化到需要为后代发育提供营养时，它不可能凭空制造出一种营养蛋白，最好的方法就是通过若干功能区(结构域,Domain) DNA“组装” 出营养或贮藏蛋白基因。所以，在不同的营养和贮藏蛋白的多肽中可能广泛存在着不同的功能区，选择适当的蛋白酶
13、就可将其释放出来，还原其功能特性，通过这种方法可以获得相当广泛的生物活性短肽。 从免疫学看，尽管不同的生物都具有功能上非常相似的蛋白质，但是由于其非功能区存在着较大氨基酸差异，所以不能互相使用，因为生物正是通过免疫系统识别自身蛋白和外来蛋白的这些非功能区的差异来清除异己和保持自身稳定性的。如果我们把注意力放在这些具有不同生理功能的生物活性短肽上，则我们可能有效地避免免疫排斥反应的困扰。例如，乳转铁蛋白用于注射可能会产生免疫排斥反应，但如果用其水解所得到的短肽，就可能安全地用于注射。再如实验证明免疫活性肽和白细胞介素相似，可以激活T细胞和巨噬细胞，从而增强机体免疫力，虽然它来源于动物蛋白，但研究
14、表明它可能安全地用于医药。 从生物多样性来看，生物的各种功能大多来自蛋白质的多样性。这是由于20种氨基酸在排列成不同长度的多肽链时，具有天文数字的多样性。所以20个氨基酸残基组成的多肽，其序列多样性足可以胜任所有生物的所有功能。也就是说，理论上所有的生物功能肽都可能以短肽的形式找到。 由于生物对营养蛋白和贮藏蛋白需求量很大，基因表达率自然很高。因此，这些蛋白在自然界蕴藏量极大。通过蛋白酶水解这些蛋白所获得的生物活性肽具有很多优点：原料廉价，成本低，安全性好，不需要很高级的实验条件和很贵重的仪器设备，便于工业化生产。大量文献表明，该研究领域发展很快，已经受到了各国科学家和政府的高度重视，在短短的
15、几年里就有众多的生物活性肽被辨认出来并进行了系统研究。有些生物活性肽已经作为保健食品和药物实现了工业化生产，并取得巨大的经济效益，如酪蛋白磷酸肽 (Casein phosphopeptides,CPPs)和类吗啡因子等。综上所述，生物活性已展示了非常好的开发和应用前景。 2.2海洋蛋白源是开发生物活性肽的重要资源之一 种类繁多的海洋蛋白氨基酸序列中，潜在着许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解，就释放出有活性的肽段。生物活性肽是世界上药物及保健品研究的热点，目前通过蛋白酶解生产的活性肽主要来源于陆地的蛋白源，如牛乳酯蛋白、大豆蛋白、玉米醇溶蛋白等。而来自海洋蛋白源酶解的活性肽非常少，但这决不意味着海洋蛋白源的蛋白质氨基酸链中没有潜在的活性肽序列，而主要是由于没有进行很好的研究开发。海洋生物资源的优化利用和高值化是未来15年我国海洋高技术发展的重要研究内容之一。 2.3酶工程技术应用于海洋蛋白酶解活性肽的研究 将陆地微生物发酵工程和酶工程技术应用于海洋蛋白资源的综合利用研究，以海洋生物蛋白资源为原料，通过生物酶解、提取、加工，可生产许多酶解陆地蛋白源和化学合成所无法生产的产品和材料，研制出系列天然、高效、新颖的生物活性肽。 首先，应大力加强用于海洋蛋白源酶解的专用蛋白酶制剂的开发。目前国内进行工业化生产的蛋白酶制剂大多是用于酶解陆地或
