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1、成都理工大学毕业设计氧化亚铁硫杆菌的分离及生物学特性研究作者姓名：冯雷专业：生物工程指导老师：谢鸿观摘要氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans,简称T. f)属革兰氏阴性无机化能自养菌、嗜酸、专性好氧,靠氧化基质中的Fe2 +为Fe3+和低价态硫为硫酸根而获取能量。它广泛存在于土壤海水、淡水、垃圾、硫磺泉和沉积硫内,尤以金属硫化矿和煤矿等酸性矿坑水中最为常见。因此，本论文从T.f菌的分离纯化出发，进行了T. f菌的生理生化及其生物活性的研究。本文从浸矿溶液中分离得到的氧化亚铁硫杆菌进行研究，结果表明硫酸亚铁相对于硫来说是一种速效能源，单质硫是长效能源，并且能提供比亚
2、铁更高的能量。关键词：氧化亚铁硫杆菌，微生物冶金，生物浸矿，分离纯化Isolation of Thiobacillus and biological characteristicsName: Feng LeiMajor: BioengineeringSupervisor: Xie HongguanAbstractFerrooxidans (Thiobacillus ferrooxidans, called T. f) ,an inorganic chemoautotroph Gram negative bacteria, acidophilus, specific aerobic, relyi
3、ng on substrate oxidation in Fe3+ and Fe2+ for the low state of sulfur to sulfuric acid roots and obtain energy，which is widely found in soil water, fresh water, waste, and deposition of sulfur in sulfur springs, especially in sulfide minerals such as acid mine water and coal the most common . There
4、fore, this paper from the T.f purification and identification of bacteria in conducting the physiological strain Af its biological activity. This separation from the leaching solution obtained ferrooxidans study results show that compared with ferrous sulfate sulfur is a kind of quick energy, sulfur
5、 is a long-lasting energy, and can provide more energy than the ferrous .Key words: Thiobacillus ferrooxidans , microbioleaehin ,Biological leaching ,isolation目 录摘要IAbstractII一、 前 言11.1生物冶金的概念11.2碲矿的生物冶金21.3氧化亚铁硫杆菌的作用31.4 本实验研究内容3二、实验部分52.1实验材料与设备52.1.1菌种采集52.1.2实验试剂52.1.3实验仪器52.1.4培养基62.2研究方法72.2.1
6、菌种富集培养72.2.2分离纯化72.2.3单层平板的制作82.2.4双层平板的制作92.2.5革兰氏染色92.2.6 pH测定92.2.7细菌计数方法92.4生物特性研究112.4.1生长曲线112.4.2氧化亚铁硫杆菌菌株对能源的利用情况112.4.3最适生长温度的测定112.4.4最适初始pH值的测定11结果与讨论12结论15致谢16参考文献1717一、 前 言矿物质是在工业生产中不可缺少的物质，是经济建设的重要物质基础。我国含有的矿产资源种类丰富，矿产已探明储量丰富。我国是一个地大物博的强大国家，但由于人口基数大，导至各种资源人均占有量低于世界平均水平。所以我国矿产资源相对紧缺，富矿多
7、数已开发利用，还有很多贫瘠矿，矿含量相对低于其它富矿，开采难度大。现有开采技术的开采方式对环境的破坏程度大，提取矿物质也不完全正确，很多矿仍不能开采。针对目前的情况，微生物浸矿是一种新的开采方式，具有溶矿率高，不污染环境等独特优势。1.1生物冶金的概念 生物冶金是利用矿物为营养基质的微生物的作用，将矿物中金属溶解，进分离、富集、纯化而提取金属的湿法冶金技术。该技术具有流程短、成本低、环境友好和低污染等特点，特别适于处理贫矿、废矿、表外矿及难采、难选、难冶矿的堆浸和就地浸出。从文献记载来看，中国是世界上最早采用生物冶金技术的国家，早在公元前六、七世纪，就在采铜、铁过程中不自觉地利用了自发生长的某
8、些自养细菌。而在欧洲，这种技术的应用至少始于公元二世纪，从1687年开始，瑞典中部Falun矿山的铜矿至少已经浸出了2百万吨铜1。在国外，铜，铀的生物提取以及含砷金矿的预氧化已实现产业化。在铜的生物提取方面，目前用生物法提取的铜约占世界总铜产量的25%，在美国、加拿大、澳大利亚、智利等20多个国家实现了生物提铜产业化。在我国，也有2座铜的生物氧化提取厂投入生产。在含砷金矿的生物预氧化方面，随着自然金开采的日益枯竭，含砷难处理金矿己成为开采对象，含砷金矿的主要矿物是黄铁矿、毒砂，金以微粒成亚显微形态包裹在硫化物中或浸染在黄铁矿、毒砂的晶格中，细磨和直接氰化法很难提取。而使用氧化亚铁硫杆菌等细菌分
9、解外部的包裹层，可使金裸露出来，有利于化学浸出，从而提高金的回收率2。目前国外至少有10个生物氧化提金厂己经筹建投产，国内也建成了2个生物预氧化黄金生产厂。在铀的生物提取方面，加拿大利用细菌浸铀的规模最大、历史最久，法国、美国、葡萄牙等国家也实现了细菌浸铀的产业化生产。目前世界范围内，生物冶金成功应用于工业化生产的主要是铜、铀和金银等,使用范围从堆浸法逐步扩展到了地浸法和原地破碎浸矿法，正在向铜、铀、锰、铅、镍、铬、钻、铁、砷、锌、铝等几乎所有硫化矿的浸出扩大。产业化相对领先的国家有智利、澳大利亚、美国、南非、日本等，中国、欧盟也从近几年先后投入大量资金开展生物冶金领域的研究。纵观全球，生物冶
10、金业化主要在三个方面，并形成两大技术3。1.2碲矿的生物冶金碲是一种稀有，但有很大利用价值的非金属资源。在地壳中的含量很少, 仅有210-7，其应用相当广泛，主要是用作钢铁有色金属的添加剂, 其次是石油, 化工生产的催化剂,橡胶的硫化剂、促凝剂, 且在玻璃电子工业中有独特用途。目前，碲已经成为世界战略需求资源，从军事到民用，碲都发挥着不可替代的作用。碲矿物有碲金矿（AuTe2）、辉碲铋矿(Bi2TeS2)和碲铜矿等，都很稀少。辉碲铋矿（tetradymite）是一种铋和碲的硫化物矿物，它具有的浅灰色带有金属光泽，并且还会褪色变暗。有叶、粒、块状等。辉碲铋矿是一种较难独立成矿的碲硫化物。在我国四
11、川石棉县大水沟发现的世界罕见的碲原生矿，有很大开发前景。此矿石含碲一般在1%到12%，个别高达36.6%；含铋一般在3%到20%，个别达40%以上4。由于碲矿分布相对分散，是一种低品位、难开采矿，同时统开采方式易造成资源浪费、环境污染、能源消耗过大等问题。而生物冶金正是能够解决上述困难的新发展方向12。本文所用的矿样为原矿经浮选获得的低品位碲精矿，是以辉碲铋矿为主的混合硫化矿，用单因子实验法进行不同pH条件下摇瓶浸出试验，探究生物浸出时的一系列适宜条件，以期提高碲矿的生物浸出率。图 11辉碲铋矿（tetradymite）1.3氧化亚铁硫杆菌的作用氧化亚铁硫杆菌是嗜酸性化能自养型细菌, 专性好氧
12、, 最佳生长pH值为2.02.5, 最佳生长温度2835, 能以氧化Fe2 + 、元素S及金属硫化物等来获得生命过程中所需能量, 并以O2 作为氧化过程中的最终电子受体。这类细菌很早就被应用于贵金属的浸出和回收, 适合于从低品位的矿石中浸出稀有贵金属。细菌浸出的方法由于具有成本低、能耗小、无污染等特点而获得广泛应用, 据报道美国有25%左右的铜是通过这种方法开采的5。此外在含硫废水处理和煤的脱硫、以及脱去硫化氢和二氧化硫等方面也有重要的应用前景。然而由于氧化亚铁硫杆菌的野生菌氧化Fe2 + 、元素S以及金属硫化物的速度慢, 生长条件要求苛刻, 以及对某些金属离子缺乏耐受能力等, 从而限制了其应
13、用范围。所以人们试图通过各种驯化与诱变育种的方法来提高氧化亚铁硫杆菌的适应范围和应用价值。在生物浸矿中，最常用的菌种是氧化亚铁硫杆菌。由于各地的氧化亚铁硫杆菌不一样，生长状况不一样，在各种环境中的含量也不同。所以在将其运用到工业生产中，首先要分离得到纯的氧化亚铁硫杆菌菌株。1.4 本实验研究内容通过对氧化亚铁硫杆菌的一些文献资料的分析，总结前人已有的成果，从实验室的浸矿溶液中分离出氧化亚铁硫杆菌，前对其的一些基本生物活性进行分析。调整培养基的各种理化条件，使其最适合氧化亚铁硫杆菌的生长，从而将此生产条件调节到此环境，以使氧化亚铁硫杆菌最大程度的进行生物浸矿。(1) 分离到氧化亚铁硫杆菌菌株。(
14、2) 分析氧化亚铁硫杆菌的生物学活性。 (2)本文研究内容：技术路线：二、实验部分2.1实验材料与设备2.1.1菌种采集本实验所用菌液为本实验室以前浸矿培养液。 2.1.2实验试剂蒸馏水，（NH4）2SO4(分析纯)，KCI(分析纯)，K2HPO4(分析纯)，MgSO47H2O(分析纯)，Ca(N03)2(分析纯)，FeSO47H2O (分析纯)，K 2Cr2O7(化学纯)，AgNO3(化学纯)，二苯胺磺酸钠(分析纯)，KSCN(分析纯)。2.1.3实验仪器本章实验所用到的主要仪器及其型号和生产厂家如表2一1所示: 表2一1 实验设备仪器名称型号产地电子天平YJ2502上海精密科学仪器有限公司
15、精密pH计PHS-3 C上海雷磁仪器厂台式高速离心机5804R德国汉堡EppendorfCor.空气浴振荡器HZQ-C哈尔滨市东明医疗器械厂数控恒温浴锅DK-98-1天津市泰斯特仪器有限公司电子分析天平FA1104N上海精密科学仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-S-301上海博迅实业有限公司医疗设备厂电热恒温培养箱DHP一9052上海一恒科技有限公司电热恒温鼓风干燥箱DHG9070A上海一恒科技有限公司图2-1 部分仪器2.1.4培养基氧化亚铁硫杆菌的代表培养基是9K培养基和利森(Leathen)培养基，其组成见图2-2。图2-2 利森(Leathen)和9K培养基的组成69K富集培养基配置方法:9K盐溶液: （NH4）2SO4,3.00g;KCl,0.10g; K2HPO4,0.50g;MgSO47H2O 0.50g; Ca(N03)2 0.01g;按此配方加蒸馏水配溶液1000mL。9K培养基:为9K盐溶液加入FeSO47H2O 44.6g/L。改进的9K固体培养基，该培养基由A液、B
