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1、个体化医学检测质量保证指南个体化医学检测质量保证指南 李金明 国家卫生计生委临床检验中心 适用范围适用范围 本指南适用于通过分析基因基因及基因结基因结 构改变构改变、基因表达基因表达及代谢变化代谢变化，对患 者疾病进行预测预测、诊断诊断、治疗决策治疗决策、 监测监测和预后预后的临床检测。 质量 保证 标本采集、标本采集、 运送和保运送和保 存（分析存（分析 前）前） 室内质控室内质控 （分析中）（分析中） 室间质评室间质评 （分析中）（分析中） 结果报告结果报告 解释及临解释及临 床应用床应用 （分析后）（分析后） 涉及临床医生 标本采集环节 和实验室 涉及实验室人 员和临床医生 涉及实验室
2、涉及实验室 分析前质量保证分析前质量保证 申请单应包括的内容申请单应包括的内容 1. 患者的惟一标识：患者的姓名、出生日期、性别、民族、 住院号、就诊科室、床号，有条件的医院尽量使用条码标 志或其他唯一标示； 2. 样本的类型：血液、其他体液、活检组织、手术切除样 本等； 3. 所申请的检验项目； 4. 患者的相关临床资料，包括初步诊断结果； 5. 样本采集日期和采集时间； 6. 实验室接受样本的日期和时间； 7. 与检验有关的既往史等； 8. 样本是否合格：有无癌变组织、血液样本有无溶血、容 器有无破损等。 9. 医生的签名。 患者的正确识别患者的正确识别 在对患者进行取血或采样前，检验人员
3、需要首先确 定患者的身份。 在对患者进行确认时，应准确核实患者的姓名、性 别、住院号等信息。对于不能说话的或意识不清醒 的患者应由相关陪同人员、医生或护士加以确认。 如果有腕带，患者的腕带上通常附有上述信息，采 血或取其他临床样本时检验人员应先确认这些信息。 样本的采集、运送和保存（样本的采集、运送和保存（1） 1. 基本原则 （1）应按照CFDA批准的检测试剂说明书制订的标准操作程序 （SOP）进行。如为实验室自制试剂，则实验室应当建立样本的采集、 运送和保存的SOP，并严格执行。 （2）样本采集和运送容器：密闭的、一次性、无菌、无核酸酶及其 他扩增抑制物。血液和骨髓穿刺样本通常需要先抗凝，
4、抗凝剂一般应 EDTA和枸橼酸盐，避免使用肝素。如检测的靶核酸为胞内RNA，试 管内应含有一定量的RNA稳定剂。 （3）实验室应向样本采集人员明确以下信息（如有可能体现在申 请单中），具体包括：采集时间；采集部位；样本类型；采集量；采 样质量的要求；拒收样本的类型。 （4）样本运送和保存中的生物安全。 样本的采集、运送和保存（样本的采集、运送和保存（2） （5）样本运送温度和时间的要求。DNA检测样本，可室温下运送， 建议8h内送至实验室。靶核酸为RNA时，10 min可室温运送，如所需 运送时间较长，则应将样本置于冰上，必须保证样本与冰屑充分接触， 且冰屑应达到样本的高度，建议采集后4h内送
5、到。 冰冻组织样本最好 保证其在运送过程中不发生融化，石蜡包埋组织则可在室温下运送。 （6）样本保存温度和时间的要求。用于DNA检测时，样本可在28 保存72h。用于RNA检测时，样本一旦采集送达实验室后，如不能立 即提取，应冻存于-70。临床体液样本的长期保存（2周）在保存 于-70。已提取纯化的RNA最好在乙醇沉淀后保存在-70。如果样 本中含有红细胞，应尽可能去除红细胞后，再进行冻存。石蜡包埋组 织则可在2-8长期保存。 常见标本的类型 血液血液 分泌物分泌物 胸腹水胸腹水 痰痰 粪便粪便 尿尿 脑脊液脑脊液 胚胎样本胚胎样本 骨髓穿刺样本/细针穿刺细胞 组织（新鲜组织、活检组织、手术切
6、除样本、组织（新鲜组织、活检组织、手术切除样本、甲醛固定的石蜡包埋组 织（FFPET） ） 临床分子诊断样本的接收临床分子诊断样本的接收 样本拒收标准：容器破损、量不够、时间不符 合要求、重度溶血、重度脂血、重度黄胆、无 靶细胞？ 用于肿瘤组织基因突变检测的样本，在分子检 测须由病理医师进行镜下肿瘤细胞评估，然后 富集肿瘤肿瘤细胞用于核酸提取。肿瘤细胞所 占比例应达到所用扩增检测方法的要求 纯化后的纯化后的DNA和和RNA的保存的保存 DNA：如果纯化后的DNA无DNA酶的污染，则可 在TE缓冲液中室温保存26周；2-8保存一年；- 20保存7年；-70保存7年以上。怀疑可能存在 DNA酶污染
7、的样本，则保存在-20以下。 RNA：RNA易于降解，在-20条件下，RNA酶 也可能发挥作用。因此，纯化后的RNA应当经过 乙醇沉淀，并在-70以下保存。 分析中的质量保证分析中的质量保证 临床基因扩增检验实验室设计临床基因扩增检验实验室设计 产物分析区产物分析区 空气流向空气流向 空气流向空气流向 空气流向空气流向 空气流向空气流向 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 专用走廊专用走廊 工作流向工作流向 扩增区扩增区 标本制备区标本制备区 试剂准备区试剂准备区 “各区独立“各区独立 注意风向注意风向 因地制宜因地制宜 方便工作”方便工作” 实验室应根据自己的检验项目、所采用的检测技术
8、平台和工作量来决定分区的多 少及各区域的空间大小。 至少具体需要多少个区，同样是“个体化”的，以“工作有序、互不干扰、防 止污染、报告及时“作为基本原则。 缓冲间的功能是“控制空气的流向”。 生物安全柜可考虑“A2”。 产前筛查与产前诊断产前筛查与产前诊断（全基因组低拷贝测序技术）（全基因组低拷贝测序技术） 缓冲间缓冲间 测序区测序区 空气流向空气流向 空气流向空气流向 空气流向空气流向 空气流向空气流向 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 专用走廊专用走廊 工作流向工作流向 文库扩增文库扩增 与检测区与检测区 标 本 与 文标 本 与 文 库制备区库制备区 试剂准备区试剂准备区 标本与
9、文库制备区标本与文库制备区 文库扩增与检测区文库扩增与检测区 测序区测序区 植入前胚胎遗传学诊断植入前胚胎遗传学诊断( (全基因组低拷贝测序全基因组低拷贝测序) ) 缓冲间缓冲间 测序区测序区 空气流向空气流向 空气流向空气流向 空气流向空气流向 空气流向空气流向 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 专用走廊专用走廊 文库检测区文库检测区 WGA制制备备区区 试剂准备区试剂准备区 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 空气流向空气流向 空气流向空气流向 电泳区电泳区 扩增一区扩增一区 遗传病诊断遗传病诊断+ +肿瘤诊断与治疗肿瘤诊断与治疗（杂交捕获测序技术（杂交捕获测序技术+Sanger+Sang
10、er测序验证）测序验证） DNA打断区打断区 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 杂交捕获区杂交捕获区 （扩增一区扩增一区） 空气流向空气流向 空气流向空气流向 空气流向空气流向 空气流向空气流向 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 专用走廊专用走廊 文库扩增区文库扩增区 （扩增二区扩增二区） 标本与文标本与文 库制备区库制备区 试剂准备区试剂准备区 文库检测区文库检测区 测序区测序区 电泳区电泳区 空气流向空气流向 空气流向空气流向 空气流向空气流向 空气流向空气流向 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 杂交捕获区杂交捕获区 （扩增一区扩增一区） 空气流向空气流向 空气流向
11、空气流向 空气流向空气流向 空气流向空气流向 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 专用走廊专用走廊 文库扩增区文库扩增区 （扩增二区扩增二区） 标本与文库制备区标本与文库制备区 试剂准备区试剂准备区 文库检测区文库检测区 测序区测序区 电泳区电泳区 空气流向空气流向 空气流向空气流向 空气流向空气流向 空气流向空气流向 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 缓冲间缓冲间 实验室仪器设备及管理 加样器加样器：维护、校准：维护、校准 扩增仪扩增仪：维护、校准：维护、校准 恒温干浴仪或水浴箱恒温干浴仪或水浴箱：维护、校准：维护、校准 离心机离心机：维护：维护 生物安全柜：维护生物安全柜：维护 冰箱：维护
12、冰箱：维护 基因扩增仪器设备的质控基因扩增仪器设备的质控 仪器设备仪器设备 质控方法质控方法 频频 度度 失控标准失控标准 扩增仪 仪器校验实验 当仪器移动时 实验失败 热电偶监测温度 扩增功能检测 每月一次 每 4 个月一次 如靶温度或温度 差异超出允许范 围 待测孔未出现扩 增，检测温度 程序打印 每次测定时 打印程序不对 加样器 校准 每年 2 次 不符合要求 水浴箱 温度检测 每次实验 不符合要求 酶标仪 预防性维护 及校准 每年 2 次 不符合要求 理想的试剂理想的试剂 试剂方法的性能验证及每批试剂的质检 性能指标： 精密度（重复性）精密度（重复性） 准确性（定量：回收率、标准物质等
13、；定性：方法学比较等） 线性范围（定量） 分析特异性 测定下限测定下限 抗干扰能力抗干扰能力 “性能验证”（“性能验证”（“verification”）定义）定义 “verification”： broadly as “confirmation through the provision of objective evidence, that specified requirements have been fulfilled” . （广义为通过提供客观证据证明特定广义为通过提供客观证据证明特定 的要求得到满足的要求得到满足） CLIA uses the term “verification”
14、： specifically to relate to confirmation that the laboratory using a test can replicate the manufacturers performance claims when the test is used according to the package insert. （CLIA性能验证术语特指性能验证术语特指 使用某特定检测试剂或系统的实验室使用某特定检测试剂或系统的实验室按照所提供的试按照所提供的试 剂盒或检测系统说明书使用剂盒或检测系统说明书使用时时，能能复现复现生产厂家生产厂家 所所宣称宣称的检测
15、性能的检测性能。） 如果不按商品如果不按商品 试剂盒说明书试剂盒说明书 操作或改变商操作或改变商 品试剂盒组份品试剂盒组份 是否可以是否可以？ 可以可以 但属于实验室但属于实验室自自 配试剂配试剂或或自建方自建方 法法，亦即，亦即 Laboratory- developed tests, LDTs) “性能确认”（“性能确认”（“validation” ）定义）定义 The FDA and ISO both define the term “validation” as “confirmation by examination and provision of objective evidence that the particular requirements for a specific intended use can be consistently fulfilled” . （通过检查和提供客观证据证明，对一特通过检查和提供客观证据证明，对一特 定预期用途的要求始终能得到满足定预期用途的要求始终能得到满足） The FDA and ISO terms for verification and
