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1、RNA提取标准流程原理：TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol使样品细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中，取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA。预防RNase污染注意事项：1 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。2 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。3 RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿、塑料制品高压灭菌，然后烘干即可。4 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度
2、0.05% v/v，充分混匀后37C放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇（可保存在-20C，用时取出置于冰上），75%乙醇，无RNase的水。所有.溶液均需用0.05% DEPC处理过的水配制。10Loading buffer（宝生物工程（大连）有限公司，货号：D603，35元，1mL5支）准备器材：1 mL、200 L枪头、小烧杯*3、1.5 mL Eppendorf管、2 mL Eppendorf管若干、报纸、卷纸、研钵，以上物品全部需要高压。操作步骤:1. 研磨+匀浆：将组织在液氮中磨碎（大体积不均一的样品，如下丘脑、海马等神经组织
3、、成年动物肾上腺等腺体，必须对整个组织研磨），取50100 mg组织样品（肝脏可减少样品量到30 mg）放入2 mL离心管中，称重记录；均一组织或者小体积的不均一组织可直接称重后匀浆。每50100 mg组织加入1 mL TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。2将匀浆样品在室温（1530C）放置5 min（可延长到15 min），使核酸蛋白复合物完全分离。 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖（如肝脏和肌肉中的糖原）或胞外物质（肌肉）可于28 10000 g离心10 min，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量基因组DNA，上清中含有
4、RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液转入2 mL管中进行下一步操作。3. 每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡60 s（可使用混匀器，也可手动剧烈颠倒混匀），室温放置3 min。（可延长震荡时间和放置时间到15 min，同GTC法）4. 4C 10000 g离心15 min。样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。（即1mL最多600l，为保证RNA质量，可适量减少抽取量，防止抽到下层）5. 记录抽取水相的量，把水相转移到新的1.5 mL Eppendorf管中，用等体积
5、的预冷的异丙醇沉淀水相中的RNA。 a. 每使用1 mL TRIzol加入0.5 mL异丙醇，室温放置10 min。 b. 可选：应对糖原含量较高的组织（如肌肉和肝脏）：每使用1 mL TRIzol在水相中加0.25 mL异丙醇和0.25 mL高盐溶液（0.8 M柠檬酸钠和1.2 M NaCl）混合离心，这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，沉淀出RNA。6. 4C 10000 g离心10 min，离心前看不出RNA沉淀（肌肉和肝脏等富含糖原的组织可能出现大量糖原沉淀），离心后在管侧和管底出现白色半透明状沉淀。弃上清。8. 向1.5 mL Eppendorf管中加入75%乙醇洗涤RNA沉淀。每
6、使用1 mL TRIzol至少加1 mL 75%乙醇。4不超过7500g离心5 min，弃上清。9. 室温放置于超净台通风口（垫上已灭菌的吸水纸）干燥RNA沉淀，大约晾510 min即可，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入适量DEPC水，记录使用的DEPC水体积（适量是指加入水后仍能保证RNA浓度至少 0.5 g/L，但不影响溶解，浓度在4 g/L以上的RNA较容易出现溶解不完全的情况），使之充分溶解（可选择4放置1 h以上或5565C水浴10 min），之后才可以进行测浓度、DNA污染的PCR验证、RNA变性电泳等后续操作。RNA应尽快转移至-70C保存。 也可用100%的去离子甲酰
7、胺溶解（用于northern的RNA可这样保存于-20C）。补充说明：1. 从少量样品（110 mg组织或102104细胞）中提取RNA时可加入少许线性丙烯酰胺等助沉剂以促进RNA沉淀。操作示例：加800 L TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加浓度为5 mg/mL的线性丙烯酰胺23L RNase-free线性丙烯酰胺溶液。它在使用时最终工作浓度应该为1020 g/mL。线性丙烯酰胺会与RNA一同沉淀出来，线性丙烯酰胺浓度不高于5 g/L不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。线性丙烯酰胺制备方法见附录1。2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70C保存至少一个月。3. 若提取的组织内源性
8、RNAase含量较高（如胰腺），可将全部过程置于冰上操作，同时适当延长放置时间。预期产量：1 mg组织或1106细胞提取RNA分别为：肝和脾610 g，肾34 g，骨骼肌和脑组织11.5 g，胎盘14 g，上皮细胞 815 g，成纤维细胞 57 g。RNA的质量控制：1. RNA的吸收峰应在260nm，左偏峰少见，右偏峰提示可能有酚污染。2. 对于RNA纯品：A260/A280=1.81 (溶于水)；A260/A280=2.04 (溶于TE：10mM Tris-HCl 1mM EDTA pH=8.0)；A260/A2302。3. nanodrop使用0.2mm光径，但默认显示的是换算后的1cm
9、光径吸光值，并非其精度能够检测3以上的吸光值（2%以下的透光率）。4. 对于ND-1000（本实验室机器型号），其RNA检出限为2-3000ng/L，大于3000ng/L需要稀释后再测。 1. 使用nanodrop测量RNA吸光值时的几点说明：图一、RNA紫外吸收光谱图三、A260/A280 4.0），混匀（避免产生气泡）倒入胶槽内，冷却2 h后使用。（放置过长时间会导致甲醛挥发，影响电泳结果）样品处理方法：将RNA稀释到1 g/L，取4.4 L（可减少点样RNA量，但需要保证体积），加2 L的10MOPS，3.6 L的甲醛，10 L的去离子甲酰胺，共20 L，混匀之后将样品置于65C水浴变性
10、15 min，迅速置于冰上冷却。之后加入2 L 10loading buffer，0.1 L EB（10 mg/mL），混匀后即可点样。电泳：5 V/cm电压，电泳约40 min后（或指示剂到胶的2/3处）照相。注: 若成像结果不佳，可选择EB后染，即不将EB混入样品中，在电泳完成后，使用1 g/mL（储存液稀释10000倍即可）的EB染胶15 min，清水脱色15 min或更长时间，图像对比度会更高，且不会出现反向的EB亮斑。电泳结果分析：好的RNA电泳图可见28S和18S的清晰图像，且亮度呈2倍的关系。图四、RNA电泳示例图，2%的变性胶，对比度经过调整美化常见问题分析：得率低：A样品裂解
11、或匀浆处理不彻底BRNA沉淀未完全溶解A260/A2801.65 ：A检测吸光度时，RNA样品没有溶于TE，而溶于了水中，低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高，水中1.51.8的比值都可能是质量较好的RNAB样品匀浆时加的试剂量太少（造成蛋白未分离完全）C匀浆样品时未在室温放置5 minD吸取水相时混入了有机相ERNA沉淀未完全溶解RNA降解：A组织取出后没有马上处理或冷冻B待提取RNA的样品没有保存于-60至-70C，而保存在了-5至-20C细胞在用胰酶处理时过度D溶液或离心管未经RNase去除处理E电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5DNA污染: A 样品匀浆时加的试剂量太少B 样品中含
12、有有机溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲体系或碱性溶液附录一、线性丙烯酰胺制备方法1. 配5%的丙烯酰胺（acrylamide）溶液：A配制buffer 100 mL（40 mM Tris-HCl （pH= 8），20 mM 醋酸钠, 1 mM EDTA）：称取2.72 g无水醋酸钠，溶于50 mL DEPC水中，向其中加入1 M Tris-Cl （pH=8.0）4 mL，0.5 M EDTA （pH=8.0）0.2 mL，加入盐酸调节pH至8.0，再加DEPC水至100 mL。B称取5 g 丙烯酰胺，加入 100 mL buffer中，高压灭菌后分装至高压过的1.5 mL管中，每管0.2 m
13、L。2. 加过硫酸铵（AP）到终浓度为0.1 %（w/v）：A配制10 % AP储存液（w/v）：称取0.1 g AP，溶解于1 mL DEPC水中。B向每管5%的丙烯酰胺溶液中加入2 L 10 % AP。3. 加TEMED到终浓度为1/1000（v/v），即向每管中加入0.2 L TEMED，室温聚合30min。4. 待溶液变粘稠，向管中加入2.5倍体积（500 L）的乙醇沉淀聚合物，-20 沉淀30 min以上。5. 12000g离心5 min，沉淀即为线性的丙烯酰胺，每管加入1mL 1TE buffer 溶解（溶解时间较长，可4 过夜）， 即得到终浓度为10 mg/mL的线性的丙烯酰胺1
14、 mL。封口膜密封保存于-20 ，可保存2年。 1TE buffer（ 10 mM Tris-Cl，pH=8.0；1 mM EDTA）配制方法：加入1 M Tris-Cl （pH=8.0）1 mL，0.5 M EDTA （pH=8.0）0.2 mL ，加入DEPC水至100 mL，高压灭菌备用。6. 使用时先加1020 g（就是12 L）到核酸（RNA、DNA均可）溶液中，之后再加相应的盐溶液和异丙醇进行沉淀。对于20 nt以上的片段，号称可以无损回收pg级的核酸。二、10MOPS （0.2 M MOPS（3-N-吗啉丙磺酸），50 mM NaAc，10 mM EDTA）配制： 先用800 mL DEPC水溶解41.2 g MOPS和6.8 g NaAc3H2O后，用10M NaOH（约7.2 mL）调溶液pH值至7.0，加入20 mL 0.5mol/L EDTA，定容至1000 mL。用0.22 mm滤器过滤除菌，装入棕色瓶中，室温避光保存。三、EB（10mg/mL）配制： 称取0.2 g EB溶
