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1、血清谷丙转氨酶活性的测定（King法）,【目的要求】 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。,【原理】 生物机体内转氨基作用是-氨基酸的氨基通过酶促作用转移到酮酸的酮基位置上，生产相应的酮酸和氨基酸的化学反应。催化这反应的酶称为转氨酶（transaminase），其辅酶为磷酸吡哆醛。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中，在肝、心、肾等组织中的谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase , GPT），谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase
2、, GOT）活性较高。在正常的新陈代谢过程中，血清内维持一定水平的转氨酶活性（即正常值）。当肝、心、肾等组织发生病变时，由于组织细胞肿胀，坏死导致大量的酶释放至血流中，从而引起血清谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性显著升高。因此测定这些酶的活性对某些疾病的临场诊断具有重要的参考价值。,血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：,生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成
3、量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。,King 氏法谷丙转氨酶活性单位：每毫升血清在 37与 pH7.4 的基质液作用 60min，生成 1mol 丙酮酸为一个单位。临床检验取血清量为 0.1mL，报告数据以 100mL 血清计算，因此实际测得结果乘 1000 即可。例如 0.1mL 丙酮酸标准液中丙酮酸含量为 0.2mol，即相当 GPT200U/100mL。,试剂与器材,1、样品 动物或人血清 2试剂 1) 甲液（1/15 mol/L 磷酸氢二钠溶液） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4，A. R.）9.47g
4、 或含水磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O，A. R.）23.87g溶于蒸馏水中定容至 1000mL。 2) 乙液（1/15 mol/L 磷酸二氢钾溶液） 称取磷酸二氢钾（KH2PO4，A. R.）9.078g溶于蒸馏水中定容至 1000mL。 取甲液 825mL，乙液 175mL 混合，此液 PH应为 7.4。 3) GPT 基质液 称取酮戊二酸 29.2mg（2mmol/L）及DL丙氨酸 1.78g（200 mmol/L）溶于 50mL pH7.4 的磷酸缓冲液中，加 0.1 mol/L NaOH溶液约 0.5mL，调节 pH为 7.4，然后加磷酸缓冲液定容至 100mL。加少许氯仿防腐
5、，置冰箱中保存。,4) 2，4二硝基苯肼（1mmol/L） 称 2，4二硝基苯肼 20mg。先溶于 10mL 浓盐酸中，使其溶解。再以蒸馏水定容至100mL。 5) 丙酮酸标准液 精确称取丙酮酸钠 22mg。加磷酸缓冲液溶解后定容至 100mL。此溶液浓度为 2mol/mL，临用前配制。 0.4mol/L NaOH 溶液，1/15 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）。 3、器材 试管及试管架，移液管（0.5mL，1 mL，5 mL），量筒（10 mL，100 mL），恒温水浴，722 型分光光度计，坐标纸。,实验内容和步骤,1) 制备标准曲线,2) 绘制标准曲线,以光吸收值为纵坐标，酶活性单
6、位数为横坐标，在坐标纸上绘制各测得A520值与对应的酶活性单位数的标准曲线。,3) 样品测定,结果计算,标准曲线测定法 根据样品管 A520 值（已减去空白管 A520）查标准曲线，即得每 100mL 血清中转氨酶活性单位数。 标准管测定法 每次测定酶活性时，同时用丙酮酸标准液（2mol/mL）0.1mL，平行操作，即按上表操作，不做标准曲线，测定A520按下公式计算：,比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间：King法60min ，Mohun法和 Reiman
7、法30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是：每1ml血清在37条件下与底物作用60 min，生成1mol丙酮酸称为一个单位。 Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37条件下与底物作用30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单位的定义是：在温度25，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单位
8、计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系：1卡门氏单位=0.4821 IU/L(25)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。,改原赖氏法的反应温度(40改为37)和底物浓度(改为低浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较为一致，能较好反映酶的真实活性。 由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后，新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性较差，在测量精度上
9、仍与连续监测法相差甚大。,注意事项,1) 为防止溶血及其他因素对酶活性测定的影响，实验过程所用的一切器皿（注射器、试管等）应清洗干净，干燥后方能使用。 2) 空腹取血，避免血脂干扰。迅速分出血清，及时测定。 3) 作为标准物质的丙酮酸钠极易变质。配试剂时应选择外观洁白干燥者。若颜色变黄或潮解，则应重结晶，干燥至衡重后再用。 丙酮酸钠重结晶：取纯丙酮 8 份与蒸馏水 2 份混合，加入变质的丙酮酸钠使其达到饱和。此时溶液上层无色，下层有棕黄色油状物。取出上层无色液体置烧杯中，加入两倍体积的丙酮（无水）混匀后，置冰箱中数小时，则有白色丙酮酸钠析出，用布氏漏斗收集沉淀，并用纯丙酮洗涤两次，抽干后，置干燥器内，保存、备用。 4) 转氨酶只能作用于L氨基酸（L天冬氨酸，L丙氨酸），对 D氨基酸无催化作用。实验室多用DL 氨基酸（因较 L氨基酸价廉），如采用L氨基酸,则需按DL 氨基酸的用量减半。 5) 为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定 PH，保温时间，选用固定的比色计，比色杯以减少误差。 6) 血清转氨酶活性高于 500（U）/100mL 血清时，应将血清稀释一定倍数重新测定，其结果应乘以稀释倍数。 7) 每次测定样品数不要太多，其数量以在显色后 30min 内完成比色为宜。,
