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1、青霉素发酵效价的生物学测定一、实验目的1、了解青霉素作用的机理2、了解青霉素效价的生物学测定的原理3、掌握管碟法测量抗生素效价的方法4、掌握青霉素摇瓶培养的操作流程二、实验原理（一）、青霉素及作用的机理1. 抗生素：是某些微生物在其代谢过程中所产生的，能抑制或杀灭其他病原微生物的化学物质；是细菌、真菌、放线菌等微生物的代谢产物。主要从微生物的培养液中提取，能杀死或抑制其他病原微生物。n 在低浓度即可对某些生物的生命活动有特异一直作用的化学物质的总称。2. 青霉素n 天然青霉素系从青霉菌的培养液中提取获得，主要含有：青霉素F、G、X、K和双氢F五种。其中以青霉素G(又名苄青霉素)的作用最强，性质
2、较稳定，产量亦较高。青霉素G的结构：青霉素钾、钠的结构：青霉素钾盐、钠盐的性质：n 遇酸、碱或氧化剂等迅速失效。 有引湿性；在水中极易溶解，乙醇中溶解，在脂肪油或液状石蜡中不溶。n 水溶液在室温放置易失效；20万IU/ml青霉素溶液于30 放置24h，效价下降 56%，青霉烯酸含量增加200倍，临床应用时要新鲜配制。（所以只有粉制剂，没有注射液，用时用注射用水稀释；如使用不完，放置不要过久）。 3. 青霉素作用机理 使细菌细胞壁缺损(黏肽)，菌体内的高渗透压使细胞外面的水分不断地渗入菌体内，引起菌体膨胀变形，加上激活自溶酶，使细菌裂解而死亡.G+(二)青霉素效价的生物学测定的原理1.效价:是评
3、价抗生素效能的标准，也是衡量抗生素活性成分含量的尺度微生物鉴定法：以抗生素对微生物的杀伤力或抑制程度为指标来衡量抗生素效价的方法理化方法：根据抗生素的结构特点，利用其特有的化学或物理性质及反应而进行的抗生素活性表示方法：抗生素的活性以效价单位来表示;每ml或每mg中含有某种抗生素的有效成分的多少，用单位u表示 一个青霉素效价单位：能在50mL肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌发育的最小青霉素剂量;以IU表示1mg青霉素G钠盐定为1667单位；1mg青霉素G钾盐为1595单位(三) 管碟法测量抗生素效价的方法1.利用抗生素在培养基内的扩散渗透作用，将已知效价的标准品溶液与未知效价的被检品溶液在同
4、样条件下加入已放置在含有高度敏感性的试验菌的培养基上的小管内2.培养后，在抗生素扩散到达的适当范围内，产生了透明的抑菌圈。不同浓度的抗生素，抑菌圈的大小不同；比较标准品与检品的抑菌圈大小，利用不同的计算原理，就可以推算出此抗菌素的效价(四)青霉素摇瓶培养的操作流程1.菌种活化:从保藏菌种接种到灭菌的斜面培养基中,25培养6-7天;待斜面上长满菌苔后作为以及菌种制备的起始菌株2.一级斜面菌种制作:从起始菌株斜面接种到灭菌的斜面培养基, 25培养6-7天,如无杂菌污染及为一级斜面菌种3.摇瓶培养:从一级斜面菌株接种到三角瓶液体培养基, 25、200rpm培养6-7天,可进行青霉素的效价测定等4.发
5、酵罐培养:流程：冷冻管 斜面母瓶（1） 大米孢子（ 2） 一级种子罐（3 ） 二级种子罐 （4） 发酵罐（5） 放罐 至提炼 各步所需培养条件：1. 25，67天； 2. 25，67天； 3. 25，4045h，1：2VVM(每分钟通气体积比) 4. 25， 1315h， 1：1.5VVM; 5. 22-26，67天，1：10.8VVM。 三. 实验材料1.菌种n 产黄青霉菌(Pentcillium chrysogenum)n 金黄色葡萄球菌(Staphyloco ccusauoreus)2.药品n 青霉素钠n 0.2mol/L pH 6.0磷酸缓冲液n 0.85%生理盐水n 发酵培养基n 生
6、物测定培养基3.仪器及器皿 移液枪 无菌枪头 接种环 酒精灯 烧杯 培养皿 滴管 试管 超净工作台等四. 操作步骤1.发酵培养基的配制:按照配方配制液体培养基，250ml三角瓶装液量为100ml。 2.摇瓶培养:从一级斜面菌株接种到三角瓶液体培养基, 25、200rpm培养6-7天,可进行青霉素的效价测定3. 青霉素标准溶液的配制:准确称取纯苄青霉素钠0.06g,溶解在pH 6.0的磷酸缓冲液, 配成100ml 1000单位/ml的青霉素标准工作液.按下表加入青霉素标准溶液1mg青霉素G钠盐定为1667单位1000/1667 mg = 0. 6mg 1000单位100ml 1000单位/ml
7、100*0.6mg=0.06g称取0.06g 苄青霉素钠溶于100ml的磷酸缓冲液不同浓度青霉素标品溶液的配制试管号 青霉素浓度(单位/ml) 1000单位/ml青霉素溶液(ml) pH 6.0磷酸缓冲液(ml) 1100192200283300374400465500554.金黄色葡萄球菌菌悬液的制备n 将37培养16-18h的斜面菌种,用0.85%的生理盐水洗下,离心沉淀(3000rpm*5min),倾去上清液,沉淀菌体再用生理盐水离心洗涤1-2次n 再将其稀释至一定浓度(约109个/ml，或用分光光度计在波长650nm测透光率为20%左右即可)。5、生测平板的制备n 配制生测培养基500
8、ml，灭菌后冷却至50，每10ml加入适当稀释的金黄色葡萄球菌0.3ml（15ml），充分混匀；在超净台中倒平板n 注意：实验中加菌体的量要控制在使10单位/ml青霉素溶液的抑菌圈直径在2024mm之间。 6. 青霉素标准曲线的绘制n 生测培养基平板完全凝固后，在每个琼脂平板上轻轻放置牛津杯2个，小杯之间的距离要均匀。然后用移液枪加入不同浓度的青霉素标准溶液，200ul/牛津杯。每个青霉素浓度做3个平行平皿n 加入标准青霉素溶液后，将平皿移至37培养箱中培养1824h，移去牛津杯。精确测定抑菌圈的直径大小。在坐标纸上,以青霉素浓度为纵坐标,以抑菌圈直径的校正值为横坐标，绘制标准曲线7. 青霉素
9、发酵液效价的测定n 根据发酵时间用1% pH 6.0的磷酸缓冲液将发酵液适当稀释.每个被测样品用3套平皿进行测定.青霉素标准液(1单位/ml)与待测样品的稀释液间隔的加入小管内.37培养18-24h后,量取抑菌圈直径的大小8.青霉素效价的计算:n 将青霉素标准液(10单位/ml)的抑菌圈直径进行校正,取得校正值;将此校正值校正待测样品的抑菌圈直径;在标准曲线上根据校正后的抑菌圈直径查得待测稀释液的青霉素效价;根据稀释度得到发酵液的青霉素效价五、试验结果1.不同浓度青霉素标品的抑菌圈直径及相应的标准曲线不同浓度青霉素标品的抑菌圈直径青霉素浓度（单位每毫升）100200300400500600每组抑菌圈平均直径（毫米）15.216.317.818.819.2202.据上面标准曲线的方程y=0.0096x+14.513(R2=0.9675),计算出发酵液的青霉素效价为发酵时间（天）样品稀释液抑菌圈直径（毫米）效价（单位毫升）发酵液稀释倍数发酵液效价718.44051405715.71131113715.382182注：由于实验过程中使用的是原液，因此稀释倍数为一 9
