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1、第七讲 原核生物的基因调控科学家把这个从DNA到蛋白质的过程称为基因表达(gene expression)，对这个过程的调节就称为基因表达调控(gene regulation或gene control)。要了解动、植物生长发育的规律、形态结构特征和生物学功能，就必须弄清楚基因表达调控的时间和空间概念，掌握了基因表达调控的秘密，我们手中就有了一把揭示生物学奥妙的金钥匙。 基因表达调控主要表现在以下几个方面： 转录水平上的调控(transcriptional regulation)； mRNA加工成熟水平上的调控(differential processing of RNA transcript)
2、； 翻译水平上的调控(differential translation of mRNA).原核生物中，营养状况(nutritionalstatus)和环境因素(environmental factor)对基因表达起着举足轻重的影响。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormone level)和发育阶段(developmental stage)是基因表达调控的最主要手段，营养和环境因素的影响力大为下降。 二、基因表达调控的基本原理（一）基因表达的多级调控基因的结构活化、转录起始、转录后加工及转运、mRNA降解、翻译及翻译后加工及蛋白质降解等均为基因表达调控的控制点。可见，基因表达调控是
3、在多级水平上进行的复杂事件。其中转录起始是基因表达的基本控制点。四个基本的调控点：（1）基因结构的活化。DNA暴露碱基后RNA聚合酶才能有效结合。活化状态的基因表现为：1.对核酸酶敏感；2.结合有非组蛋白及修饰的组蛋白；3.低甲基化。（2）转录起始。最有效的调节环节，通过DNA元件与调控蛋白相互作用来调控基因表达。（3）转录后加工及转运。RNA编辑、剪接、转运。（4）翻译及翻译后加工。翻译水平可通过特异的蛋白因子阻断mRNA翻译翻译后对蛋白的加工、修饰也是基本调控环节。（二）基因转录激活调节基本要素1DNA序列原核生物大多数基因表达调控是通过操纵子机制实现的。操纵子通常由 2个以上的编码序列与
4、启动序列、操纵序列以及其他调节序列在基因组中成簇串联组成。启动序列是RNA聚合酶结合并起动转录的特异DNA序列。多种原核基因启动序列特定区域内，通常在转录起始点上游-10及-35区域存在一些相似序列，称为共有序列。大肠杆菌及一些细菌启动序列的共有序列在-10区域是TATAAT，又称Pribnow盒（PribnowBox），在-35区域为 TTGACA。这些共有序列中的任一碱基突变或变异都会影响RNA聚合酶与启动序列的结合及转录起始。因此，共有序列决定启动序列的转录活性大小。操纵序列是原核阻遏蛋白的结合位点。当操纵序列结合阻遏蛋白时会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合，或使RNA聚合酶不能沿DNA
5、向前移动，阻遏转录，介导负性调节。原核操纵子调节序列中还有一种特异DNA序列可结合激活蛋白，使转录激活，介导正性调节。顺式作用元件就是指可影响自身基因表达活性的 DNA序列。在不同真核基因的顺式作用元件中会时常发现一些共有序列，如 TATA盒、CCAAT盒等。这些共有序列就是顺式作用元件的核心序列，它们是真核RNA聚合酶或特异转录因子的结合位点。顺式作用元件通常是非编码序列。顺式作用元件并非都位于转录起点上游（5端）。根据顺式作用元件在基因中的位置、转录激活作用的性质及发挥作用的方式，可将真核基因的这些功能元件分为启动子、增强子及沉默子等。2调节蛋白原核调节蛋白分为三类：特异因子、阻遏蛋白和激
6、活蛋白。特异因子决定RNA聚合酶对一个或一套启动序列的特异性识别和结合能力。阻遏蛋白可结合操纵序列，阻遏基因转录。激活蛋白可结合启动序列邻近的DNA序列，促进RNA聚合酶与启动序列的结合，增强RNA聚合酶活性。真核调节蛋白又称转录因子。绝大多数真核转录调节因子由某一基因表达后，通过与特异的顺式作用元件相互作用（DNA-蛋白质相互作用）反式激活另一基因的转录，故称反式作用因子。有些基因产物可特异识别、结合自身基因的调节序列，调节自身基因的开启或关闭，这就是顺式作用。具有这种调节方式的调节蛋白称为顺式作用蛋白。3DNA-蛋白质、蛋白质和蛋白质相互作用DNA-蛋白质相互作用指反式作用因子与顺式作用元
7、件之间的特异识别及结合。这种结合通常是非共价结合。绝大多数调节蛋白结合 DNA前需通过蛋白质-蛋白质相互作用形成二聚体或多聚体。所谓二聚化就是指两分子单体通过一定的结构域结合成二聚体，它是调节蛋白结合DNA时最常见的形式。由同种分子形成的二聚体称同二聚体，异种分子间形成的二聚体称异二聚体。除二聚化或多聚化反应，还有一些调节蛋白不能直接结合DNA，而是通过蛋白质一蛋白质相互作用间接结合DNA，调节基因转录。4RNA聚合酶DNA元件与调节蛋白对转录激活的调节最终是由RNA聚合酶活性体现的。启动序列启动子的结构，调节蛋白性质对RNA聚合酶活性影响很大。(1)启动序列或启动子与RNA聚合酶活性：原核启
8、动序列或真核启动子是由转录起始点、RNA聚合酶结合位点及控制转录的调节组件组成。会影响其与RNA聚合酶的亲和力，而亲和力大小则直接影响转录起始频率。（2）调节蛋白与RNA聚合酶活性：一些特异调节蛋白在适当环境信号刺激下在细胞内表达，随后这些调节蛋白通过DNA-蛋白质相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用影响RNA聚合酶活性，从而使基础转录频率发生改变，出现表达水平变化。三、原核基因表达调控原核生物的调控主要发生在转录水平上，根据调节机制的不同分为负转录调控和正转录调控。在负调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），起着阻止结构基因转录的作用。根据作用特征又可分为负诱导作用和负阻遏作
9、用。在负诱导系统中，阻遏蛋白不与效应物（诱导物）结合时，结构基因不转录；在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（activator）。在正控诱导系统中，诱导物的存在使激活蛋白处于活性蛋白；在正控阻遏系统中，效应物分子的存在是激活蛋白处于非活性状态。（一）原核基因调节特点因子决定mRNA识别特异性 原核生物细胞仅含有一种RNA聚合酶，核心酶参与转录延长，全酶司转录起始。在转录起始阶段，亚基（又称因子）识别特异启动序列；不同的因子决定特异基因的转录激活，决定tRNA、mRNA和rRNA基因的转录。（二）乳糖操纵子调节机制1乳糖操纵子的
10、发现细菌能随环境的变化，迅速改变某些基因表达的状态，这就是很好的基因表达调控的实验型。人们就是从研究这种现象开始，打开认识基因表达调控分子机理的窗口的。大肠杆菌可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而生长繁殖。当培养基中有葡萄糖和乳糖时，细菌优先使用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间的适应，就能利用乳糖，细菌继续呈指数式繁殖增长(图191)。说明酶可以诱导。在不含乳糖及-半乳糖苷的培养基中，lac+基因型每个大肠杆功细胞内大约只有1-2个酶分子。如果在培养基中加入乳糖，酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，每个细胞中可有超过105个酶分子。当有乳糖供应时，在无葡萄糖培
11、养基中生长的lac+细菌中将同时合成-半乳糖苷酶和透过酶，如图。用32P标记，结果表明培养基中加入乳糖1-2min后，编码-半乳糖苷酶和透过酶的lac mRNA量就迅速增加。去掉乳糖后，lac mRNA量立即下降到几乎无法检测到，表明乳糖确实能激发lac RNA的合成。事实上，研究诱导作用时很少使用乳糖，因为培养基中的乳糖会被诱导合成的-半乳糖苷酶所催化降解，从而使其浓度不断发生变化。实验中通常使用乳糖类似物：异丙基硫基半乳糖苷（IPTG）、琉甲基半乳糖苷（TMC）和O-硝基半乳糖苷（ONPG）。它们都是高效诱导物，因为它们都不是半乳糖苷酶的底物，所以又称为安慰性诱导物（gratuitous
12、inducer）。为了证明诱导物的作用是诱导新合成酶而不是将已存在于细胞中的酶前体物转化成有活性的酶，把大肠杆菌细胞放在加有放射性35S标记的氨基酸但没有任何半乳糖诱导物的培养基中繁殖几代，然后再将这些带有放射活性的细菌转移到不含35S、无放射性的培养基中，随着培养基中诱导物的加入，-半乳糖苷酶便开始合成。分离-半乳糖苷酶，发现这种酶无35S标记。说明酶的合成不是由前体转化而来的，而是加入诱导物后新合成的。操纵子模型的提出 莫洛(Monod)和雅各布(Jacob)获1965年诺贝尔生理学和医学奖1940年， Monod发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基上生长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，
13、才利用乳糖；在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿。即产生“二次生长曲线”。1947年，报告：“酶的适应现象及其在细胞分化中的意义”。1951年，Monod与Jacob合作。发现两对基因：Z基因：与合成-半乳糖苷酶有关；I基因：决定细胞对诱导物的反应。Szilard：I基因决定阻遏物的合成，当阻遏物存在时，酶无法合成，只有有诱导物存在，才能去掉该阻遏物。Jacob：结构基因旁有开关基因（即操纵基因），阻遏物通过与开关基因的结合，控制结构基因的表达。2结构大肠杆菌的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码-半乳糖苷酶、透酶、乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因。基因
14、编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于转录失活状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白CAP结合位点，由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成LAC操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。A P-O区P区是从I基因结束到mRNA转录开始点为止，而O区的范围是抑制物结合区。mRNA是从第85对碱基开始的，所以P区共84个碱基，抑制物结合区从78112，共35对碱基，和P区有7个碱基的重复。使这段序列可能无法同时结合RNA聚合酶和阻遏蛋白，也可能虽然可以同时结合，但无法形成开放的转录起始复合物。P-O区碱基对的命序，是从mRNA
15、起始的第一个核苷酸为1与转录方向一致的为正，与转录方向相反的为负。所以P区从84到1，抑制物保护区是7到28。B阻遏蛋白的负性调节当大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，1ac操纵元处于阻遏状态。i基因在其自身的启动子Pi控制下，低水平、组成性表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白。R以四聚体形式与操纵子O结合，阻碍了RNA聚合酶与启动子P1ac的结合，阻止了基因的转录起动。R的阻遏作用不是绝对的，R与O偶尔解离，使细胞中还有极低水平的半乳糖苷酶及透过酶的生成。当有乳糖存在时，乳糖受半乳糖苷酶的催化转变为别乳糖，与R结合，使R构象变化，R四聚体解聚成单体，失去与O的亲和力，与O解离，基因转录开放，半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍。这就是乳糖对1ac操纵元的诱导作用。一些化学合成的乳糖类似物，不受半乳糖苷酶的催化分解，却也能与R特异性结合，使R构象变化，诱导1ac操纵元的开放。例如异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside, IPTG)就是很强的诱导剂，不被细胞代谢而十分稳定。Xgal(5溴4氯3吲哚半乳糖苷)也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X_gal都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。C.CAP的正性调节
