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1、酒酒球菌在干猕猴桃酒中初步降酸作用研究一、 主要研究内容1、 初步研究酒酒球菌对干猕猴桃酒中的降酸效果。2、 研究干猕猴桃酒中酸降的主要成分及其酸降幅度。二、 主要技术指标（或研究目标）1、 确定酒酒球菌对干猕猴桃酒的降酸效果。2、 使用纸层析法测出酸降主要成分及酸降幅度。三、 原理猕猴桃酒是由新鲜的猕猴桃经破碎后发酵酿制而成，在酿制猕猴桃酒的过程中，猕猴桃大部分营养成分如多种氨基酸、矿物质、Vc，有机酸等都转移到了酒中，所以猕猴桃酒是具有较高营养价值的果酒之一。尽管酿造猕猴桃酒已有很长的时间 ，但猕猴桃酒的质量在诸多方面有待提高，其中很重要的一方面就是由于猕猴桃原酒的酸度过高，其滴定酸高达
2、14gL 左右（以酒石酸计，以下的滴定酸都以酒石酸计），因此如能找到一种合适的降酸方法，就可以大大提高猕猴桃酒的可口性。目前所用的降酸方法主要有化学降酸法 、生物降酸法 及物理降酸法 。化学法降酸需要加入一定量的化学试剂，而消费者更喜欢天然的、无化学添加剂的产品。生物降酸法适用于主要有机酸为苹果酸的果汁或酒液，虽然猕猴桃酒的苹果酸含量并不高， 但通过生物降酸后可改善风味和香气，提高生物稳定性，对提高干猕猴桃酒的质量起着不可替代的作用。目前国内干猕猴桃酒的生产使用化学降酸法和物理降酸法，对干猕猴桃酒生物降酸的研究较少。在果酒的酿造过程中，由酵母菌菌引发的酒精发酵是葡萄酒的主发酵，而由苹果酸一乳酸
3、菌(malolactic bacteria,MLB)引发的苹果酸一乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)，是果酒的次级发酵。由于苹果酸一乳酸发酵通常是在酒精发酵结束后进行的，因此又称之为“二次发酵”或“次级发酵(secondary fermentation)。苹果酸乳酸发酵主要是由酒类酒球菌完成，酒类酒球菌可将苹果酸分解成乳酸和CO2,使粗糙酸涩的新酒变得柔和圆润，同时MLF中的副产物如双乙酰、2,3-丁二醇等有关的醇和酯如果适量不但能增加香气，也可改善口味，提高葡萄酒的风味；苹果酸生理活性较高，提早进行MLF，避免了被细菌利用和发生再发酵，提高了葡萄酒的生物稳定性
4、。 图1 苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation,MLF）苹果酸-乳酸发酵的监控用纸层析法，纸层析基本原理为：以滤纸为惰性支持物的一种分配层析法。它利用物质在固定相和流动相中分配、吸附以及亲和作用的差异，使混合物中各组分得到分离。猕猴桃果汁或果酒中含有多种有机酸如酒石酸、苹果酸、柠檬酸，由于不同的有机酸的极性和分子大小不同，展层时，各有机酸随展层剂在两相溶剂中不断进行分配，以不同的移动速率在滤纸上形成距原点距离不等的层析点而得到分离，用染色剂染色后观察。比较显色斑点面积定性分析样品中所含酸的含量。四、 试验材料原料：猕猴桃（）菌种：酒酒球菌（），干酵母仪器及其他：双螺
5、旋榨汁机，量筒，培养皿，三角瓶，移液管，吸耳球，接种环，酒精灯，超净工作台，摇床，恒温培养箱，酸度计，滤纸，电子天平，数字pH计，毛细管，分光光度计，棉塞，纱布，报纸，线试剂：1gL溴酚蓝-正丁醇溶液，50%乙醇溶液，H2SO3，白糖，偏亚硫酸钠，明胶钠基膨润土，琼脂，K2CO3培养基：ATB培养基 蛋白胨1%，葡萄糖1%，酵母浸膏0.5%，MgSO47H2O 0.2gL，MgSO44H2O 0.05gL，番茄汁25%，盐酸半胱氨酸0.5gL,115灭菌30min。 模拟葡萄酒培养基（gL）葡葡萄汁2（vv%体积分数），苹果酸3，酒石酸3，柠檬酸0.5，酵母0.35，SO2 0.02，酒精浓度
6、10（vv%体积分数），蒸馏水配制，121灭菌20min。番茄汁培养基 (gL)酵母膏1.0，蛋白胨20，葡萄糖14，苹果酸0.05，Tween-80 1.0，柠檬酸二铵1.0，MgSO47H2O 0.1，MnSO4H2 O 0.001，盐酸半胱氨酸001，番茄汁25(vv体积分数)，115灭菌30min。五、 方法步骤1、 猕猴桃酒的初步酿造11 猕猴桃分选 猕猴桃具有后熟的特性，作为酿酒的猕猴桃必须达到其生理成熟度方可采收，否则，果实后熟时将缺乏养料，致使酸高糖低，缺乏果实应有的风味，不能酿出高质量的猕猴桃干酒为此，控制好酿酒猕猴桃的采收成熟度非常重要。必须选择成熟度达89成，均匀一致的鲜
7、果。组织过硬的青果不利于加工。果实一般在白露以后采收，风味较好。以光皮黄肉为佳，别除霉烂、病虫和伤果12 清洗 用清水洗去果实表面附着的泥土、部分檄生物等。13 破碎 猕猴桃果实含有较多的果胶，它的果汁粘度较大。果肉中蛋白质、纤维素和木质紊含量均比一般水果高，而结构又脆弱。在破碎鲜果时，若破碎太细，许多细小的纤维素易将撼布孔堵住，造成过滤困难；若将果肉破碎得较大块，其组织内部汁液因粘性作用，单靠外界的挤压力是难以完全把汁液从果肉破碎组织中分离出来。为了提高出汁率并减少维生素c的损失，可采用双螺旋榨汁机榨汁，并用离心分离机提汁的方法，每lh处理猕猴桃鲜果700kg，提取果汁640kg，液汁105
8、Bx左右，以上，维生素c的损失由人工挤汁的50，下降到18以下。14 分离果汁 将破碎后的果肉块装入80一100目的丝质滤袋中，每袋约4kg，扎紧袋口，装人离心机中，分离出果汁。15 澄清果汁 猕猴桃果汁的透明度、果酒的澄清以及瓶装酒的稳定性等是猕猴桃果酒生产中的难题，通过反复试验、比较，择使用钠基膨润土与明胶相结合的澄清方法。称取明胶50g加水100ml，浸泡12h（500Kg猕猴桃酒的用量），水溶化(75)，完全溶解后，缓慢加人果汁中，并不断搅拌，精静置24h，再加人配制好的钠基膨润土。明胶在使用前应用清水,漂洗几次。钠基膨润土配制：称取钠基膨润土15Kg，用清水配成80%浓度，静置24h
9、，倾去上清液以殊去水溶性杂质。使用量一般在03左右。加人到果酒中，静置45天待果酒澄清后面清液过滤。此法能大大提高过滤速度，降低成本，并可保持果2年以上的稳定性，操作方便，且不需任何机械设备。明胶与膨土结合使用，澄清果汁能改进果酒的风味。16 果汁糖度的调整 猕猴桃原果汁含糖分不足，需添加白砂糖来弥补，才能正常发酵达到需要的酒度，按所需酒精度换算所要添加的砂糖置，以17g糖100ml生成1度酒精计算。 同时在果汁中加入适量的亚硫酸，使SO2含量达到100mgL，防止果汁氧化褐变，并且可加快酒液澄清，还可引起防腐灭菌效果。17 主发酵 在果汁中加入4的经活化后的干酵母，保持发酵温度在20一28，
10、发酵时问为20一30天，当残糖下降到2gL以下时，应立即分离酒脚，倒桶，转人后发酵阶段。2、猕猴桃酒的后酵与降酸 2.1 猕猴桃酒降酸前总酸的测定 （氢氧化钠滴定法） 使用移液管移取2mL猕猴桃果汁（果酒）于250mL三角瓶中，加入50mL蒸馏水，摇匀。加入2滴酚酞作指示剂，立即用氢氧化钠标准溶液滴定至终点（微红色，并保持30s不变色），记下消耗的氢氧化钠标准溶液的体积V1。对50mL蒸馏水进行滴定作空白实验，消耗氢氧化钠标准溶液的体积即为V2。总酸的计算公式：式中：X每升样品中总酸的克数，gL-1；c氢氧化钠标准溶液的浓度，molL-1；V1滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2空
11、白试验消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V样品体积，mL；F样品的稀释倍数（试验中为1）；K酸的换算系数（酒石酸为0.075）。2.2 猕猴桃酒的降酸及其效应研究 此处采用三种降酸方法降酸，以作比较，分别为：a、物理降酸，将经主发酵后的猕猴桃酒放置-5进行自然降酸；b、化学降酸，在经主发酵后的猕猴桃酒中加入酒石酸钾、K2CO3室温放置降酸；c、生物降酸，在经主发酵后的猕猴桃酒中加入酒酒球菌，分三个梯度研究，5%、7%、9%，用氢氧化钠滴定法监控降酸幅度及降酸进程，采用纸层析法研究降酸成分。纸层析过程 在纸层析缸中倒入展层剂，饱和过夜。选用国产新华1号滤纸，剪成长条状；用铅笔轻轻划出起点线（距离
12、滤纸一端1cm）和终点线（离滤纸另一端1cm）。取毛细管若干，分别取样品液按顺序点于滤纸上，点样量为1030微升。注意：斑点的直径不要大于5mm，因此每个样品要分次点（23次），每次点样后，用电吹风吹干再点。点样时要小心，以免把滤纸弄破。将滤纸条轻轻垂直放入展层缸内的培养皿中央（点样线应在展层液液面以上），盖上盖，采用上行法展层。当展层剂去前沿至终点线约两厘米是，取出滤纸。用电吹风吹干滤纸，均匀喷上显色剂，在用电吹风吹干。观察试验结果。此降酸研究猕猴桃酒均放在250ml三角瓶中，每瓶加入150ml猕猴桃酒，每种方案做三个平行试验，共15瓶。2.3 猕猴桃酒降酸后总酸的测定 （氢氧化钠滴定法，同2.1） ，比对各酸降方法进行比较，确定酒酒球菌对干猕猴桃酒的降酸效果，并测出酸降的主要成分及酸降幅度。
