《(医疗药品管理)生物荧光肿瘤体外药敏检测技术的临床应用及其探讨doc生》由会员分享，可在线阅读，更多相关《(医疗药品管理)生物荧光肿瘤体外药敏检测技术的临床应用及其探讨doc生（25页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、生物荧光肿瘤体外药敏检测技术的临床应用及其探讨张 伟关键词: ATP生物荧光技术 肿瘤药敏检测 化学治疗已经是治疗恶性肿瘤的常规有效手段之一，有资料显示肿瘤内科治疗及多学科的综合治疗已提高了癌症的疗效。然而，由于肿瘤本身特性的原因存在个体差异性，即便是同一组织学类型、分化程度相同肿瘤，对药物的敏感性和药物敏感谱也显著不同，肿瘤化学治疗疗效的不均一性是肿瘤临床医师一直要应对的重大挑战。 目前，化疗药物的疗效仍然较低。以胃癌为例，目前胃癌患者的单药化疗有效率仅为15%-30%，如常用药物丝裂酶素（ MMC）有效率为30%，5-Fu有效率为21%，表阿霉素（EDI）有效率为19%，联合化疗的有效率仅
2、为30%-50%1。在大家公认具有较高的化疗疗效的乳腺癌的治疗新药紫杉醇（PTX）一线单药有效率为32-62%，二线有效率仅为26%-33%；泰索帝（TXT）单药有效率59%，而二线有效率仅为40%；长春瑞宾（NVB）初治有效率为40-44%，复治有效率仅为17-36%。其它的肿瘤化学治疗药物也普遍存在疗效低的问题。 肿瘤化学治疗药物本身局限性的影响，导致化疗和方案的选择不可避免的具有一定的盲目性。由于化疗药物多具细胞毒性, 不当的治疗会产生严重的毒副作用和联合耐药，最终可能会导致治疗失败。因此，如何能在患者化疗之前检测出该患者肿瘤细胞对药物的敏感性，提高化疗用药的针对性和准确性，准确预见体内
3、治疗效果，从而为患者筛选出相对有效化疗药物，为临床医师较确定化疗方案和开展有的放矢的个体化治疗提供科学依据是摆在科学家面前亟待解决的重要课题。 建立能为患者和医生在体外检测、筛选相对有效抗肿瘤药物的技术，并实现该技术的产业化、操作流程标准化和评价标准规范化，对于提高肿瘤治疗用药的科学性和最大限度发挥已有药物的治疗作用具有重要意义。 肿瘤的体外药敏试验研究已经有数十年的历史，所及技术也有十余种。至2000年与临床有关的类似报道已逾5000篇。大量国外临床研究表明肿瘤体外药敏检测与临床疗效存在一定的相关性；体外药敏检测能够较好的指导临床用药、提高临床疗效以及延长病人的生存期2-10。体外检测肿瘤对
4、化疗药物的敏感性的主流方法包括软琼脂克隆形成实验（HTCA），四唑蓝比色法 (MTT)，细胞毒性差异染色方法 (DiSC)，胸腺嘧啶掺入法 (H3-T)，立体组织培养法等。但由于这些方法在某方面存在较严重的技术缺陷而难于实现产业化和标准化（表1），导致各实验室间的研究结果可比性差，技术难于普遍推广应用。 因此，一种具有适当敏感性和具有较高特异性，可产业化、操作流程标准化、评价标准规范化和操作自动化的技术是当今药敏技术成熟性的的标志。表1：常见体外药敏检测方法的技术缺陷 11体外药敏检测方法存在问题软琼脂克隆形成实验（HTCA）标本易污染导致可评价率低（ 30-40%）实验周期长，需要4周以上测
5、试药物种类和数量少方法难以标准化，各实验室间结果可比性差阳性预测值较低，仅有4060%四唑蓝比色法 (MTT)敏感性和重复性差，最低仅能检测500个细胞有效量程在2.0以内，敏感性不够细胞毒性差异染色方法 (DiSC)可适用标本类型少，仅适用于血液肿瘤人为判断因素较大，技术难以推广标本可评价率不高，仅有50-60%阳性预测值较低，仅有60- 70%胸腺嘧啶掺入法 (H3-T)实验人员接触放射，不利于健康和环保标本可评价率低，仅有7080%测试结果仅能反映少量处于增殖相的肿瘤细胞阳性预测值较低，仅有5375%假阴性率高，重复性差1 ATP-TCA技术原理和特点1.1 技术原理 ATP生物荧光技术
6、产生于七十年代中期。1983年，Moyer等提出内源性三磷酸腺苷(ATP)的数量可以反映细胞的活性度12。随后，Kangas（1984）、Kuzmits（1986）等相继证实该技术是一种敏感而可靠的确定各种细胞活性度的检测方法13,14。1988年，Sevin等将ATP生物荧光技术应用于卵巢癌体外肿瘤药物敏感性检测（ATP-TCA），其主要技术原理为： 内源性ATP是活体细胞最基本的能量来源。细胞死亡时，ATP迅速水解。因此测定细胞内源性ATP的含量可以即时反映细胞的活性和活细胞数量12-14。荧光酶在有氧条件下,可以和荧光素结合后催化ATP转变成AMP,并且释放出荧光（波长为562 nm），
7、测定所产生的荧光强度,与标准曲线比较即可推测活细胞的数量。肿瘤细胞经体外给药培养后，计算出化疗药物各个系列浓度对培养细胞的不同抑制率，参照相应判断指标，从而评估该化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效果11,15。1.2 主要技术流程 ATP-TCA肿瘤体外药敏检测操作流程主要为（图1-1）11,15：1.2.1 肿瘤单细胞悬液制备：本步骤操作先将新鲜瘤组织剪碎成大小1mm3的碎块，然后加入组织消化酶（如胰酶、胶原酶）37孵浴消化23小时， 细胞悬液通过160200目的筛网过滤后获得单细胞悬液。1.2.2 肿瘤细胞接种于96孔板，设置不加药对照，在不同药物浓度培养56天。1.2.3 提取ATP，荧光扫描仪
8、测定荧光强度，结果传输计算机。1.2.4 软件分析药物各浓度抑制率，计算IC50和IC90，绘制抑制曲线，评估药物作用。1.3 技术特点和评价标准 技术特点 ATP-TCA法以细胞内源性ATP含量作为细胞活性度测定终点，药物作用时间长达5-6天，能反映出药物对不同细胞周期的作用；同时该方法可检测出多种药物以及同种药物各种不同浓度的杀伤作用。此方法敏感，且为定量检测，所需细胞数量小其对标本的可评价率较其它方法高，适宜于药敏检测11-15。该方法已越来越多地得到认可，大量研究表明ATP-TCA方法较集落形成抑制法(HTCA)及MTT法在评估细胞活力方面具有较优的敏感性和特异性16-17。同时，该技
9、术测试可以从96孔板、384孔板放大到1536孔板，适用于小型化及高通量筛选。培养基的体积对测试结果影响很小，1536孔板数据的统计结果显示Z因子为0.84，表明该技术具有良好的区分阳性和和阴性对照样品的能力18。最近来自体外细胞毒性评估中心的报告也显示细胞内源性ATP分析是最有预测性的细胞毒性测试方法（表2）18。表2：ATP-TCA方法技术特点小结敏感性高可检测最少20个细胞。而其他技术则一般需要500个细胞以上标本可评价率高标本可评价率在90%以上快速检测完成ATP检测仅需30分钟，而其它方法需14小时的孵育时间量程宽检测线性范围为20160000个细胞/孔（96孔培养板）精密度好变异系
10、数（CV）小于10%，在国家标准（10%）的范围内体内体外符合率高乳腺癌和卵巢癌实验结果和体内药物治疗反应一致性高达85%检测效率高同时动态检测评估化疗药物6个剂量下对肿瘤的杀伤作用高通量检测适合96、384、1536孔板检测分析，Z因子为0.84自动化程度高实验数据计算机软件自动分析，分析结果客观可靠评价标准强 敏 感(SS)： IC5025%及IC90100%PPC中度敏感(IS)： IC50100%PPC轻度敏感(MS)： IC50 25%及IC90 25%及IC90 100%PPCIC90: 抑制90%肿瘤细胞生长的血浆峰值浓度IC50: 抑制50%肿瘤细胞生长的血浆峰值浓度 PPC
11、: 药物进入体内后在血浆中所形成的最高浓度1.4 ATP-TCA与其它已知体外药敏技术的相关性 Kangas等1989年证实：ATP生物荧光技术是一种敏感、可靠的确定各种细胞活性度的方法，与集落形成法具有较好的相关性（相关系数为0.76）17；Rhedin等人1993年证实该方法与差示染色法（DiSC）检测结果亦有较高的一致性（相关系数为0.81）19；1998年Taylor等人研究ATP-TCA与MTT法后得出了同样的结论（相关系数为0.83）20。该方法与传统药敏检测技术有较高的相关性使该技术的可信性进一步提高。2 ATP-TCA体外药敏实验与临床相关性的研究 体外药敏实验能否最终被推广应
12、用最关键的问题是体外检测结果是否与临床治疗反应间具有相关性。自从该技术被应用于药敏检测以来，国际上已经进行了近20年的临床试验研究，现将主要研究成果介绍如下： 1987年，Perras首先将此方法用于新鲜卵巢癌组织的药敏检测。随后，欧洲、美国和日本进行了大量的临床相关性研究，体外药敏检测的肿瘤类型也由卵巢癌扩展到了胃肠道肿瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、白血病。国外研究资料表明ATP-TCA的体外药敏测试结果与临床疗效具有较好的相关性（表3）15, 21-28。表3：国外ATP-TCA与临床疗效相关性研究资料时间国家研究人肿瘤类型结论1988年美国Sevin BU, Peng ZL卵巢癌阳性预测值：
13、92%，阴性预测值：90%整体预测精确值：86%1990年日本Jinushi K, Hirabayashi胃癌预测精确性为88.9%1993年瑞士Koechli OR, Avner BP乳腺癌阳性预测值：90%，阴性预测值：86%整体预测精确值：85%1995年美、英、德三国协作Andreotti PE， Cree IA顺铂耐受卵巢癌整体预测精确值：92%1996年英国Cree IA, Kurbacher CMIII/ IV期乳腺癌整体预测精确值：761997年日本Kawamura H, Ikeda K胃肠道肿瘤阳性预测值：64%，阴性预测值：100%整体预测精确值：84%2000年美国Kon
14、ecny G, Crohns CFIGO 期卵巢癌阳性预测值：66%，阴性预测值：89%敏感性：95%，特异性：44%2000年德国Mollgard L, Tidefelt U急性非淋巴细胞性白血病阳性预测值：86%，阴性预测值：100%2001年美国OMeara AT, Sevin BU上皮性卵巢癌阳性预测值：83%，阴性预测值：56.5%2003年德国KebacherCM卵巢癌ORR:75% vs35%, OAS: 28.5M vs14MAvner BP乳腺癌 P0.00012003年中国张 凯卵巢癌阳性预测值：94.7% 阴性预测值：84.6% 特异性：91.7% 敏感性：91% 整体预
15、测值：86%2.1 为治疗后复发的患者筛选敏感性药物，设计个体化治疗方案 建立可靠的体外肿瘤药敏检测方法，可以通过帮助临床医师选择有效的化疗药物，合理的设计治疗方案，避免无效药物所致的副作用，提高治疗效果。 1998年，德国科隆大学医学中心Kurbacher等人报道了ATP-TCA辅助化疗与传统化疗比较的临床期试验结果，试验结果表明，ATP生物荧光体外检测肿瘤化疗敏感性技术指导的化疗治疗复发性卵巢癌较传统化疗模式而言更能提高临床疗效（65% Vs 45%），延长病人总生存期和无进展生存期，两种化疗模式比较差异极其显著（P0.0009 和P0.0016）29。 2001年，OMeara和 Sevin等人研究ATP-TCA辅助化疗在上皮性卵巢癌治疗中的应用。研究结果表明ATP-TCA辅助化疗能够明显延长病人
