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1、 第一章 体外试验与生物新技术 在毒理学中的应用第一节 体外试验 毒性试验的目的在于获取一定的数据，为社会需要的外源化学物的安全使用做出判断。过去利用整体实验动物模型或称体内试验(in vivo test)模型所提供的资料，判断外源化学物及其制品和混合物等对人类健康是否具有损害作用。体外试验模型(in vitro test)在上述过程中也起着重要的作用，尤其是机理研究方面。但是，在毒理学研究中整体试验研究的观点仍占主导地位。目前，此种观点已发生变化，因为：全世界每年约有千种以上的新化合物作为商品进入人类的环境。而且在现有的化合物中，还有相当数量没有进行必要的毒理学评价。在此种情况下，利用经典的
2、整体动物试验取得完整的毒理学资料极为困难。解决此种问题的重要方向是体外试验。现有的整体动物毒性试验方法需消耗大量的时间和昂贵的经费，而体外试验则可节省时间和经费。动物保护主义运动的兴起，要求尽量减少动物的使用，而且应当尽量减少痛苦地处理动物。更重要的是由于生物技术的巨大进步，不仅表现在细胞组织及器官培养领域，而且在生物分子技术方面，也为毒性试验和研究提供了新的方法和工具。所以体外试验在毒理学研究中所占的地位日趋重要，甚至有占主导地位的趋势。但也需指出，体外试验的发展，并不排斥体内试验本身的重要性，两者必须相互补充、相互验证才能为毒理学研究提供坚实的科学基础。 一、概述 (一) 分类 毒性试验的
3、目的是提供一些适当的资料，以便确定有关化学物的毒理学性质。在有些情况下，是要决定一种化学物在所预期的条件下使用是否安全，如新药物开发即需要这一评价。在有些情况下，例如新工业品或日用化学品的开发，必须决定一种新化学物的接触安全限量。了解体外毒性试验在上述毒理学决策过程中有何意义，对于评价体外毒性试验在毒理学中的地位极有帮助。可依据体外试验在决策过程中所起的作用将其分为3类：筛选试验。它仅提供决策过程的最初的资料，还需要进行更权威的试验，无论是整体还是体外试验。附加试验。它可为协作部门或法律部门的最终决策过程提供有用的资料，如机理的研究，但仅有它是不够充分的。替代试验。它是在大量实验的基础上，使体
4、外毒性试验能替代整体动物试验，以提供更多的信息。 (二) 基本原理 体外试验的基本原理是所观察到的毒理学效应均是毒物和或反应活性代谢产物在敏感性细胞上或敏感细胞内某一分子靶部位作用的结果。如将敏感细胞或某分子靶部位例如酶，在体外条件下，维持其正常的生理功能，并观察外源化学物对其的影响，即将毒理学中毒物中毒的启动阶段，在体外条件下，观察其对外源化合物的反应和外源化学物对它的作用。基于上述原理，体外试验模型取材范围很宽，可取哺乳动物的离体脏器灌流、脏器切片温育、细胞培养、亚细胞器组份以及提纯的某些酶分子或DNA分子等等。 (三) 体外试验的优缺点 体外毒性试验的优点可归纳在表121。表12-1 体
5、外毒性试验系统的优点能控制环境因素可排除相互作用的系统如免疫系统、神经内分泌系统的影响每一剂量水平可利用大量的生物样品，如细胞，细胞器等试验间的误差较少可同时和或反复多次取样可做成复杂的互相作用的试验系统，如复合细胞培养等较为快速和经济需要较小量的受试化合物产生较小量的有毒废物可以利用人体细胞减少整体动物的使用 其中特别值得一提的优点是体外试验的简便和易于利用人体细胞。体外毒性试验结果可迅速得出，将减少了解新化学物毒理学资料所需的时间，最终可以缩短从新化学物的合成到产品进人市场的时间过程。此外，对鉴定毒理学资料有问题的新化学物，可及时终止开发，减少由资源到产品的投入。在毒理学整体试验中禁止直接
6、进行人体试验。但毒理学试验的目的是关心人类健康，目前主要是将动物试验结果外推至人类，物种间差异为其不确定因素之一。在体外试验中，利用人体细胞组织进行试验，可较好地解决物种差异的问题。 体外毒性试验系统的利用在目前尚有不足之处：体外到体内外推的问题。体外试验是依据毒性作用的始发阶段及继续发生的分子与细胞反应，其与整体系统有差异，如何将产生体外毒性的体外浓度与相应体内剂量联系的问题是最终未解决的难题。它需要更好的工具预测性毒物代谢动力学来解决，其关键在于发展有生理学基础的毒物代谢动力学模型。另一方面，体外毒性试验中缺乏毒理学反应的调控因素，如细胞与组织的修复过程和免疫系统的不同类型细胞间的相互影响
7、等。假如有了更全面的毒理学过程的基础知识，可设计更符合整体动物模型的体外系统。但现阶段毒理学作为一个学科的发展尚缺少许多重要的资料。体外毒性试验难以预测慢性毒性。因为，慢性毒性病理过程的机理所知甚少，缺乏发展体外试验的理论依据，再者，某些体外系统仍难以达到长期维持生理状态的要求。 二、体外试验系统 (一) 脏器灌流 1. 肝脏灌流 是毒理学中研究外源化合物对肝脏损伤及代谢的常见方法。在灌流液中加入外源化学物，此外要维持灌流液的pH值、氧含量，还要控制适宜的灌流液流速。一般是以下腔静脉和门静脉为插管灌流通路，为此应结扎肝动脉、上腔静脉，在恒温条件下灌流。有报道用肝灌流方法研究四氯化碳及其氢取代衍
8、生物三氯甲烷与二氯甲烷对肝脏毒性，结果发现随着灌流时间延长(在4h之内)，灌流液的上清液中K+、谷丙转氨酶(SCPT)、山梨醇脱氢酶(SDH)、谷氨酸脱氢酶(GDH)增加，说明三种化合物对肝细胞均有损伤，而以四氯化碳为最，且依氯原子被氢取代肝毒减低。需指出肝灌流时间不能过久，以4h之内为宜，否则肝细胞的功能与生存不能维持。 2. 肠灌流 利用某一部分小肠体外灌流可以研究一些化合物的吸收及动力学过程。如用大鼠，则在麻醉下切腹分离一段小肠，在保持原有血液循环体系下，将肠两端插管，清洗净肠中内容物，在恒温环境中灌入灌流液。例如有人研究锌的吸收及其影响因素，以大鼠回肠段为标本，证实锌吸收呈二室模型(肠
9、腔为室、肠粘膜为室)，苯丙氨酸能增加肠腔与肠粘膜之间锌的交换，且加速向血流的清除过程。 3. 膈肌-膈神经标本 取完整的大鼠膈肌-膈神经置于恒温灌流液中，在几小时之内可维持基本正常的神经肌肉传导。这种标本可用在研究神经毒物对神经传导功能的损伤及强度。 (二) 脏器切片 肝脏、肾脏、脑部及心均可以制备切片。例如，脑片和心肌条等是将组织片置于恒温的孵育液中进行有关试验研究，但需注意切片中的细胞需保持完好的细胞基质和细胞之间的交流。切片厚度一般在250m。不同研究期间有别，如肝切片研究CytP-450不应超过8h，脑切片一般在6h左右。此系统的优点是保持了细胞之间的结构，其操作也比脏器灌流容易。不足
10、之处是切片内的细胞易于缺氧，且受试物也不易均匀到达细胞内。 (三) 原代细胞培养 1. 肝细胞原代培养 肝细胞尚未建成传代的细胞株系，多用原代培养。肝细胞原代培养期间细胞不分裂、不增殖，但发现基因转录是存在的(培养初期24h在1或以上)。细胞原代培养维持生存期12周，但是CytP-450却在2428h活性减少50左右。据报道人肝细胞中CytP-450活性稳定性比大鼠强。 利用原代培养的肝细胞可以进行多种毒理学研究。如研究化学物的肝脏毒性，一般认为，用原代肝细胞培养筛检与鉴定是否化学物具有肝脏毒性较为可靠，与体内试验相符合。有报道以肝细胞损伤后某些酶释放为指征，研究30个化学物，结果除少数化学物
11、在肝细胞培养中表现毒性比体内试验低之外，多数化学物内外毒性符合一致。在体外试验表现毒性较低的化学物有环已酰胺(cycloheximiole)、溴苯(bromobenzene)和长春新碱(vincristine)等。 2. 巨噬细胞 豚鼠或大鼠都可以肺灌洗方法获取肺巨噬细胞，小鼠可用腹腔灌洗获得腹腔巨噬细胞，甚至人也可通过肺灌洗得到。巨噬细胞可以用于多种体外试验，例如利用巨噬细胞的免疫功能检测外源化学物的免疫毒性，又如利用巨噬细胞检测以肺脏为毒理学终点的外源化学物的中毒毒性和机理。关于后者，有人利用豚鼠肺巨噬细胞原代培养纯化后，研究二氧化硅(silica，SiO2)致矽肺的机理。 3. 淋巴细胞
12、 多用小动脉脾脏分离淋巴细胞或进一步分离T、B淋巴细胞进行免疫毒理研究。例如研究镉的免疫毒性，证明镉可以抑制淋巴细胞转化和抑制白细胞介素-2的产生，且在一定条件下使淋巴细胞内游离钙浓度增加及钙调素(CaM)活性降低，此为镉的免疫毒性机理研究提供了线索。 4. 脑细胞 分离的新鲜脑细胞有助于研究外源化学物对神经系统损伤的评价与探讨其机理如用小鼠大脑皮质分离、温育后，研究二价阳离子钙、镁、锌、镉等对皮层神经细胞的损伤，发现这些离子随着浓度的增加，脑神经细胞的电泳迁移率逐渐减慢。 随着脑细胞技术的发展，还可在温育体系中存在外源化学物情况下，用微电极插入脑细胞，通过电信号的变化，更深入地研究外源化学物
13、对神经细胞的功能损伤。 5. 心肌细胞 心肌细胞用于毒理学研究的报道目前还较少。用新生12日龄大鼠心室肌分离心肌细胞，原代培养4天后，将微电极(直径0.5um)插入细胞内，研究镉对心肌的影响。经记录、分析各心肌细胞动作电位参数，结果镉在520molL浓度下，可使心肌细胞动作电位及最大除极速率显著降低，表明镉对心肌有直接的毒性效应。 此外，将分离的心肌细胞于培养的2448h期间，利用膜片钳的连细胞电压钳法，描记心肌细胞上的B型、L型及T型3种Ca2通道的单通道活动。当在培养液中加入10molL氯化镉之后，B型通道开放时间缩短13、关闭时间延长45.1、通道开放概率下降55，L型通道开放时间缩短4
14、0.7、关闭时间延长23.1、通道开放概率下降50，而对T型通道无影响。进一步证实镉对心肌有毒性效应。 (四) 细胞培养 有些脏器细胞建立了传代培养技术，建成有稳定遗传特征的细胞株系。有的利用细胞培养技术建立了特殊的试验方法。 1. 肾细胞 由于肾小管，尤其是肾近曲管是肾脏重要的功能单位，目前已经建立了几种肾近曲管细胞株系用于毒理学研究。例如1926年Hull等人选育传代培养的LLC-PK1细胞是来源于Hampshire猪。据报道此株系细胞的各种生物学特征已进行了相当深入的研究(包括激素应答反应、物质转运特征、细胞的代谢功能和标志等)。此后又建立了从鼬(opossum)获得的OK株系、从兔获得
15、的RC-SVI株系。 近年国内利用300次传代培养的LLCPKl细胞系对铅的肾毒进行了研究，包括铅对细胞的损伤、对细胞膜脂流动性的影响、对细胞膜相变温度的影响、脂质过氧化效应、胞内钙浓度变化及形态学改变等，这对铅的肾脏毒性机理提供了依据。 2. 胚胎细胞 利用胚胎细胞体外培养，筛检和研究外源化学物的毒性效应。例如我国用人胚肺纤维母细胞传代培养人胚肺二倍体细胞，已建立了以2BS为代表的株系。此株系在用于筛检致癌物方面做了一些工作。如人胚肺二倍体细胞在10-710-8molL苯并(a)芘长达2838代传代培养下，电镜镜检发现细胞核外形不规则、核膜深陷、出现细桥(tiny bridge)伴分叶核形成、核内胞浆包涵体、核仁巨大或多核等细胞癌变特征。 此外，人胚主动脉平滑肌细胞也可作为标本传代培养研究金属的毒理。 近十年来，毒理学相继引入啮齿类动物的着床前全胚胎培养技术(pre-implantatation whole embryo culture)、着床后全胚胎培养技术(post-implantation whole embryo culture)，以及器官培养如腭板培养、胚胎枝芽体外培养等筛检致畸化学物均取得一些成果。
