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1、.,第四章 植物病害检疫检验技术,.,第一节 植物检疫性真菌常见检疫检验技术,直接检验 比重检验 染色检验 洗涤检验 保湿萌芽检验 分离培养检验,.,1、适用范围 混杂在种子间的较大病原体（线虫瘿、菌核） 污染大量病菌孢子的种子（小麦腥黑穗病） 种子带明显病症的病粒（小麦黑胚病）,（一）直接检验-肉眼检验,小麦黑胚病粒,腥黑穗病,.,在检查时应先进行外表和周围的检查，然后，由表及里仔细观察病害症状、菌瘿、菌核等病症。 对于苗木、接穗、插条等，应注意茎、叶、芽、根各部位，并需检查粘着和夹带的土壤。 对块茎、块根以及鳞茎，应特别注意芽眼、凹陷处、伤口和附着的土壤。,主要工具：放大镜或解剖镜。,检查
2、要求：,.,2、检验方法： 将送验样品分出一半试样，放在白纸或白色塘瓷盘中，检出线虫瘿、麦角菌、黑粉菌球、菌核及病粒，称其重量，计算病害感染率。,.,3、注意 无病征的种子不一定是无病的种子。 不同的病害可以表现类似的症状， 同一病害也可产生不同的症状。 在确定某种病害时，须与其他方法配合使用。,.,1、适用范围 检查混杂在种子内较大的病原体如菟丝子、菌核、线虫瘿和杂草种子等。 利用病原体与种子形状、大小的不同，通过一定的筛孔将病原体筛出来，然后进行分类称重。,（二）过筛检验,大豆菟丝子为害,.,2、检验方法 将送验样品分出一半作为试样，用规定孔径的筛子过筛。 各层样品倒入白瓷盘内检查，最下层
3、的杂质倒入黑玻璃盘中用肉眼或放大镜检查。,病原体含量(%)=,病原体重量(g),试样重量(g),100,过筛检验主要用于检验粮谷、种子、油料、干果和生药材。,.,1、适用范围：种子表面带病而肉眼看不见的种子病害。（附着在种子表面的病菌孢子）,（三）洗涤检验,小麦矮腥黑穗病菌,.,洗涤检验法原理：主要用于检查附着在种子表面的各种真菌孢子。种子表面常附着真菌孢子，将一定量的样品放入容器内，加一定量的无菌水，充分振荡，可使病菌孢子洗涤下来，而后离心后，可沉淀，镜检沉淀物可确定其种类和数量。 主要仪器和试剂：振荡器、离心机、显微镜、0.1吐温溶液等,.,2、检验方法： 样品制备：取样(5g)2份于10
4、0ml三角瓶内，加蒸馏水10ml（加0.1吐温溶液），振荡510min， 显微计数：悬浮液20003000r/min离心515min，吸去上清液，留1ml沉淀部分，滴于5个载玻片，加盖玻片镜检，每片检查10个视野，并计算每视野平均孢子数,N=n1n2n3/m 式中： N每克种子的孢子负荷量 n1每视野平均孢子数 n2盖玻片面积上的视野数 n31ml水的滴数 m供试样品的重量（g）,.,如果镜检洗涤液时，没有检查到病菌孢子，则对同一样品要重复几次取样洗涤，对每一洗涤液至少要镜检5张玻片。当一个样品两次取样，洗涤检验的结果相差很大时，则需要重复一次。,.,检验结果有四个影响因素： a种子或其他粮谷
5、类产品表面所粘附的病菌孢子，不一定能完全洗涤下来。,b在离心管内，悬浮液表面常形成一层极难沉降的孢子薄膜，而管壁上也可能粘附着孢子，使检验结果很难代表实际情况，因而影响计算的准确性；,c将悬浮液滴于玻片时，由于孢子迅速沉淀，造成一些视野间孢子分布极不均匀，这也影响计数的准确性，都可能增加误差程度；,d操作不够严格，会造成人为误差，以及制样中也会出现偏差。,.,原理：由于菌瘿、菌核、病秕粒，都要比健康籽粒轻。若将其浸入一定浓度的食盐水（糖、泥土等）或其他溶液中时，就会浮于液面。捞取浮物，结合解剖镜进行检验，即可鉴定其种类。,（四）比重检验法,比重检验法一般用于检验种子、粮谷、豆类中的菌瘿、菌核和
6、病秕籽粒等。,.,原理：某些植物或植物器官被病原感染后，或某些病原物本身，常可用特殊的化学药品处理，使其染上特有的颜色，帮助检出和区分病虫种类。这种方法即为染色检验法。 例如：马铃薯癌肿病（薯块上癌瘤不明显时，可做徒手切片，加1滴1的“藏花红”染色液，健康组织细胞壁呈亮红色，感病组织细胞壁呈暗红色。 麦类赤霉病的检验：将病粒放在0.5-1%对硝基苯胺酒精溶液中，经2-3小时，受侵染部分或有菌丝分布的部分呈现暗红色至咖啡色，而未受侵染部分为黄色，50温度下颜色更明显。,（五）染色检验法,.,（六）解剖检查法,有许多病害或一些病害初发生阶段，在种子、苗木及其他植物产品表面没有明显的症状，诊断比较困
7、难 有时为要了解病原物潜伏的场所，常常需要用解剖检验进行鉴定，如散黑穗病菌以菌丝体在胚中越冬,有的果树病害以菌丝体在花芽或鳞片中越冬。,.,解剖检验主要采用徒手切片或切片机切片，经过染色，制成玻片标本后，放在显微镜下观察鉴定。对于某些病害或种子苗木及其产品，有时采用粗放的解剖方法也可进行检查。,.,（七）保湿萌芽检验 原理：种子携带的真菌，无论外表黏附的还是潜伏种子内的，在种子萌发阶段即可开始侵染，甚至有些在种子还未萌发时就可长出病菌。 主要仪器及试剂：吸水纸、沙土、冰箱、培养箱等。,常规植物病理学方法,.,保湿萌芽检验的方法： 1、保湿培养检验 2、沙内萌芽检验 3、土内萌芽检验 4、试管幼
8、苗症状测定,.,1保湿培养检验 此法一般又分为：吸水纸法、冰冻吸水法和琼脂平皿法等。,(1) 吸水纸法 广泛用于各种类型的种子，包括禾谷类、豆类、麻类、烟草、各种蔬菜、观赏植物和树木种子等种传真菌病害的检验。,.,吸水纸法的标准操作： a 用三层无菌吸水纸，吸足无菌水后，滴掉多余的水，放人经消毒的培养皿内，将种子排列在吸水纸上。 b 各粒种子间要保持一定距离，一般不得少于1-1.5cm，再将培养皿置于适当温湿度的恒温箱培养。 c 在培养期间，每天用12h光照和黑暗交替处理，保持一定周期。 d 作物种子和病菌一般经2-10d培养，种子表面就会长出待检病菌，最后进行镜检。,.,优点:设备简单，应用
9、范围广，操作方便；花费少，快速准确，易于掌握；受检病症立体感强，容易鉴定和便于制作标本等。 缺点:在此条件下，有些真菌的菌丝生长不旺盛和产孢量少，而很快被许多杂菌快速生长，超过或掩盖被检病菌。,吸水纸法的特点：,.,(2)冰冻吸水法 这是一种改进的保湿培养法，其操作步骤如下： a 种子排列在吸水纸上，一般谷物种子在10下保持3d，使其先萌芽。 b 20的温度下，保持2d（其他种子在20下保持4d)。 c 再将幼苗在-20的温度下，进行冰冻过夜，以死亡的幼苗作为培养基。 d 20的温度下，用光暗交替处理12h，保持5-7d。 为了防止细菌的污染，可在吸水纸上加些抗生素，如210-4金霉素或土霉素
10、等数滴。,优点：有利于病原物形成孢子，同时又避免因种子萌芽伸长后造成相互覆盖，便于检查。,.,(3)琼脂平皿法 此法与吸水纸法所不同之处，就是用1.5%-1.7琼脂，经灭菌后倒入无菌培养皿中，制成一定厚度的平面，代替吸水纸。 优点：因含水量均匀一致，有利于病原菌生长，皿内洁净，杂菌少，便于检查，因此常用于植物检疫检验。,琼脂平皿法用于棉花枯、黄萎病菌的检验。,.,将沙用清水洗去泥垢，然后用沸水煮过，铺在经酒精或福尔马林液消毒过的萌芽器内，加冷开水至含沙量的60左右。 沙面应低于容器边缘4cm，在铺平的沙上排列种子，间隔一定距离。排好种子后，再加细沙覆盖2-3cm，并加容器盖，置于25的温箱中。
11、 当第一个幼芽长高碰到顶盖时，即应去盖。经过一定时期，将幼芽连根取出，并取出发芽的种子，根据幼苗和未发芽种子所表现的症状及种苗上有无孢子，就可计算发芽率及发病率。,2沙内萌芽检验,.,3土内萌芽检验 将种子播种在含有灭菌土壤的盆钵或播种箱内，保持适宜发芽的温、湿度。待种子发芽出土后，进行检验，分析其发病情形。,.,4试管幼苗症状测定 做试管斜面，每管放人1粒种子，塞紧管口。再置于20下，用人工光照和黑暗各半处理。当幼苗达到管顶时，即可将管盖取掉。待培养期到后，检查幼苗症状。,保湿萌芽检验的优点: 容易检查根部和绿色部分，也可避免相互传染，但操作较麻烦，一般可用于检验珍贵的繁殖材料。,.,保湿萌
12、芽检验的缺点： 1、在对寄主生长发育不良，而适宜于病菌生长发育的条件下，则某些腐生菌可能变成萌芽阶段的寄生菌，造成幼芽发生部分病斑。,2、由于主要还是依靠肉眼检查，多种病害可以产生类似的病症，就是同一种病害也可发生不同的症状等，这些情况都足以影响检验结果的准确性。,.,（八）分离培养检验,分离培养主要应用于检验潜伏于种子、苗木或其他植物新产品内部，不易发现和鉴定的病原菌；或当种子、苗木或其他植物产品上虽有病斑，但无特殊性的病原菌可供鉴定的场合。 不同的病原菌，其所用的培养基、分离方法、培养条件等不尽相同，必须因病制宜地加以使用。 通过分离培养所得到的待检病菌，应通过必要的步骤进行仔细鉴定。,.
13、,分离真菌的方法有： 1、组织分离法： 将样品材料经表面消毒并冲洗后切成小块，轻轻置于培养基平板表面，写好标签后，即可培养观察。,2、稀释分离法：将寄主组织受害部位的孢子洗下配成悬浮液，经稀释后与熔化并冷却45左右的琼脂培养基混合，然后倒在灭菌的培养基中。,.,从种子、苗木及其他繁殖材料上获得的病菌，有时还需接种到植株上，使其表现典型症状后，再检查鉴别。,（九）接种方法,.,由于病原种类与传播方式不同，其接种的方法也各不相同，常用接种方法有下列几种： (1)拌种接种：用病菌孢子拌种，是接种黑粉病（如矮腥黑穗病）最常用的方法。 (2）浸种接种：用病原真菌孢子悬浮液浸种，也是常用的接种方法。 (3
14、)花期接种法：主要用于从花期侵入的病菌。如：大麦、小麦散黑穗病菌的接种。在抽穗后1-2天，用冬孢子悬浮液注射到花内。 (4）整株喷雾接种：孢子悬浮液喷在叶片或茎部 (5)土壤接种法：针对一些土传病菌，如棉花枯、黄萎菌。,.,核酸技术是一种DNA分析鉴定技术，其方法快速、准确，因此，在植物病原菌的分类鉴定和亲缘关系分析等方面已有广泛的应用。 核酸技术基于PCR（聚合酶链式反应），它是一种体外DNA扩增技术，由于其快速、准确、所需样品量少的特点，十分符合植物检疫检验过程的要求。根据不同的检疫对象，需设计出特异性的引物，就可鉴定特定的病原菌。,（十） 核酸技术,.,(十) 隔离种植检验 不易发现症状
15、或病原物，需要在生长发育阶段进行病害观察或分析鉴定。 隔离种植应在温室或极为严密的隔离区进行，并在各个生长发育阶段进行观察。,.,对不同的病害，用不同的方法：,1. 2. 3. 4. 5.,对较大的病原体,过筛,肉眼,对种子外表有明显症状的,表面带菌但看不见的,洗涤,滤纸培养,胚内病菌,离体胚培养,种子内部的病原菌,琼脂培养,肉眼,.,.,第二节 植物病原细菌检疫检验技术,主讲：王晓东 副教授,.,所有已知植物细菌病害都可以通过种苗传播，通过种子传病的占40以上，准确检测种子和种苗是否携带检疫性病原细菌，是防治这类病害的关键。,一、病原细菌的检测,.,植物病原细菌的检测方法，大致可分为直接检测
16、和间接检测两大类。 直接检测：检测病原细菌时，病原物不被提取或分离出来。 间接检测：先把病原细菌提取、分离或破坏以后进行检测。 又分为活菌检测和非活菌检测。,.,（一）直接检测,1.直观检验 直观检验是以症状为主的田间检测，植物细菌病害的产地检疫主要是以这种方式进行的。 通过肉眼观察植株的症状、菌脓以及镜检观察，并结合田间诊断结果而做出。,.,.,.,快速诊断细菌性病害方法-细菌溢,.,2. 生长检验 ：生长检验有实验室和田间幼苗症状检验两种。 (1)实验室检验：这种检验是将种子播种在湿润吸水纸上，或水琼脂培养基平板上，根据幼芽和幼苗症状做出初步诊断。 (2)田间幼苗症状检验：此法常受到环境条件的影响。 在植物检疫中，生长检验多作为初步检验。,.,（二）间接检测,1. 活菌检测 （1）分离培养法检验 A 分离病原细菌 一般用稀释分离法。稀释分离有以下两种方法。 培养皿稀释分离法 平板划线分离法,.,培养皿稀释分离法,.,平板划线分离法,取小块病组织用灭菌玻棒研碎。静置一定时间，用灭菌的
