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1、第六章 酶的非水相催化 人们以往普遍认为只有在水溶液中酶才具有催化活性。酶在非水相介质中催化反应的研究:在理论上进行了非水介质（包括有机溶剂介质，超临界流体介质，气相介质，离子液介质等）中酶的结构与功能、非水介质中酶的作用机制，非水介质中酶催化作用动力学等方面的研究，初步建立起非水酶学（non-aqueous enzymology）的理论体系。非水介质中酶催化作用的应用研究，取得显著成果。 1.酶非水相催化的研究概况酶在非水介质中进行的催化作用称为酶的非水相催化。1.1有机介质中的酶催化：有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物
2、质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。酶在有机介质中起催化作用时，酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性和热稳定性等都有所改变。1.2气相介质中的酶催化：气相介质中的酶催化是指酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。由于气体介质的密度低，扩散容易，所以酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。 1.3超临界流体介质中的酶催化：超临界介质中的酶催化是指酶在超临界流体中进行的催化反应。用于酶催化反应的超临界流体应当对酶的结构没有破坏作用，对催化作用没有明显的不良
3、影响；具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性；超临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或在酶催化的最适温度附近；超临界压力不能太高，可节约压缩动力费用；超临界流体要容易获得，价格要便宜等。1.4离子液介质中的酶催化：离子液介质中的酶催化是指酶在离子液中进行的催化作用。离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。在酶的非水相催化中，研究最多的非水介质是有机溶剂。酯酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等水解酶，过氧化氢酶、过氧化物酶
4、、醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、多酚氧化酶、细胞色素氧化酶等氧化还原酶以及醛缩酶等转移酶中的十几种酶都可以在适当的有机溶剂介质中起催化作用。而且酶在有机介质中的热稳定性比水溶液中显著提高。在理论上进行了非水介质（包括有机溶剂介质，超临界流体介质，气相介质，离子液介质等）中酶的结构与功能、非水介质中酶的作用机制，非水介质中酶催化作用动力学等方面的研究，初步建立起非水酶学（non-aqueous enzymology）的理论体系。并进行了非水介质中，特别是在有机介质中酶催化作用的应用研究，利用酶在有机介质中的催化作用进行多肽、酯类等的生产，甾体转化，功能高分子的合成，手性药物的拆分等方面均取得显著成果。
5、2.有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响2.1有机介质反应体系：常见的有机介质反应体系包括：(1)微水介质（microaqueous media）体系:微水介质体系是由有机溶剂和微量的水组成的反应体系，是在有机介质酶催化中广泛应用的一种反应体系。微量的水主要是酶分子的结合水，它对维持酶分子的空间构象和催化活性至关重要。另外有一部分水分配在有机溶剂中。通常所说的有机介质反应体系主要是指微水介质体系。(2)与水溶性有机溶剂组成的均一体系：这种均一体系是由水和极性较大的有机溶剂互相混溶组成的反应体系。酶和底物都是以溶解状态存在于均一体系中。由于极性大的有机溶剂对一般酶的催化活性影响较大，所以能在
6、该反应体系的进行催化反应的酶较少。(3)与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系：这种体系是由水和疏水性较强的有机溶剂组成的两相或多相反应体系。游离酶、亲水性底物或产物溶解于水相，疏水性底物或产物溶解于有机溶剂相。如果采用固定化酶，则以悬浮形式存在两相的界面。催化反应通常在两相的界面进行。一般适用于底物和产物两者或其中一种是属于疏水化合物的催化反应。(4)（正）胶束体系：胶束又称为正胶束或正胶团，是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂包在液滴内部。反应时，酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶
7、束内部。反应在胶束的两相界面中进行。(5)反胶束体系：反胶束又称为反胶团，是指在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液，加入表面活性剂后形成的油包水的微小液滴。表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，水溶液包在胶束内部。反应时，酶分子在反胶束内部的水溶液中，疏水性底物或产物在反胶束外部，催化反应在两相的界面中进行。2.2水对有机介质中酶催化的影响：(1)水对酶分子空间构象的影响：酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential water）。必需水与酶分子的结构和性质有密切关系。不同的酶，所要求的必需水的量差别很大。(2
8、)水对酶催化反应速度的影响：有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。在催化反应速度达到最大时的水含量称为最适水含量。在实际应用时应当根据实际情况，通过实验确定最适水含量。(3)水活度： 在有机介质中含有的水，主要有两类，一类是与酶分子紧密结合的结合水，另一类是溶解在有机溶剂中的游离水。研究表明，在有机介质体系中，酶的催化活性随着结合水量的增加而提高。水活度（water activity, Aw）是指体系中水的逸度（fugacity）与纯水逸度之比。通常可以用体系中水的蒸汽压与相同条件下纯水的蒸汽压之比表示。即：Aw = P/P0式中，P为在一定条件下体系中水的蒸汽压，Po为在相同条件下纯
9、水的蒸汽压 研究表明，在一般情况下，最适水含量随着溶剂极性的增加而增加。而最佳水活度与溶剂的极性大小没有关系。所以采用水活度作为参数来研究有机介质中水对酶催化作用的影响更为确切。2.3有机溶剂对有机介质中酶催化的影响：常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。(1)有机溶剂对酶结构与功能的影响：酶具有完整的空间结构和活性中心才能发挥其催化功能。在有机溶剂中，酶分子（经过修饰后可溶于有机溶剂者除外）不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应。有些酶在有机溶剂的作用下，其空间结构会受到某些破坏，从而使酶的催化活性受到影响甚至引起酶的变性失活。(2)有机溶剂对酶分
10、子表面结构的影响：酶在有机介质中与有机容剂接触，酶分子的表面结构将有所变化。(3)有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响：当酶悬浮于有机溶剂中，有一部分溶剂能渗入到酶分子的活性中心，与底物竞争活性中心的结合位点，降低底物结合能力，从而影响酶的催化活性。有机溶剂分子进入酶的活性中心，会降低活性中心的极性，可能降低酶与底物的结合能力。(4)有机溶剂对酶活性的影响：有些有机溶剂，特别是极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶的变性失活。有机溶剂极性的强弱可以用极性系数lgP表示。P是指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数。极性系数越
11、大，表明其极性越小；反之极性系数越小，则极性越强。研究表明，有机溶剂的极性越强，越容易夺取酶分子结合水，对酶活力的影响就越大。极性系数lg P 2的极性溶剂一般不适宜作为有机介质酶催化的溶剂使用。(5)有机溶剂对底物和产物分配的影响：有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。有机容剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度。一般选用2lg P5的有机溶剂作为有机介质为宜。3.酶在有机介质中的催化特性3.1底物专一性：在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性会发生改变。 不同的有机溶剂具有不同的极性，
12、所以在不同的有机介质中，酶的底物专一性也不一样。在极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物容易反应；而在极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物容易反应。3.2对映体选择性：酶的对映体选择性（enantioselectivity）又称为立体选择性或立体异构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。酶立体选择性的强弱可以用立体选择系数（KLD）的大小来衡量。立体选择系数越大，表明酶催化的对映体选择性越强。立体选择系数与酶对L-型和D-型两种异构体的酶转换数（Kcat）和米氏常数（Km）有关。即： ( Kcat/Km)L KLD = (Kcat/Km)D式中，KLD ：立体选择
13、系数L: L-型异构体D: D-型异构体Km: 米氏常数。即酶催化反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。Kcat: 酶的转换数。是酶催化效率的一个指标。指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。酶在有机介质中催化，与在水溶液中催化比较，由于介质的特性发生改变，而引起酶的对映体选择性也发生改变。酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性强的有机介质中，酶的立体选择性较差。3.3区域选择性：酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性（regioselectivity）, 即酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。酶区域选择性的强弱可以用区域选择系数Krs 的大小来衡量。区域选择系数与立体
14、选择系数相似，只是以底物分子的区域位置1，2，代替异构体的构型L,D。即：K1，2 =(Kcat/Km)1 /(Kcat/Km)2 3.4键选择性：酶在有机介质中进行催化的另一个显著特点是具有化学键选择性。键选择性与酶的来源和有机介质的种类有关。3.5热稳定性： 许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的热稳定性更好。酶在有机介质中的热稳定性还与介质中的水含量有关。通常情况下，随着介质中水含量的增加，其热稳定性降低。在有机介质中，酶的热稳定性之所以增强，可能是由于有机介质中缺少引起酶分子变性失活的水分子所致。某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性如表7-1所示。 表7-1 某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性 酶 介质条件 热稳定性猪胰脂肪酶三丁酸甘油酯水， pH7.0T1/2 26 hT1/2 2 min酵母脂肪酶三丁酸甘油酯/庚醇水，pH7.0T1/2 =1.5 hT1/2 2 min脂蛋白脂肪酶甲苯，90，400 h活力剩余40胰凝乳蛋白酶正辛烷，100水，pH 8.0, 55T1/2 = 80 minT1/2 = 15 min枯草杆菌蛋白酶正辛烷，110T1/2 = 80 min核糖核酸酶壬烷，110，6 h水，pH 8.0, 90活力剩余95T1/2 24
