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1、现代生物技术与食品安全,一、概述,进入20世纪中叶，随着人类生产力的发展，人类对环境的索取越来越多，而还给环境却是污染。由此而引发了许多疾病和食品的污染，故食品安全也越来越成为世界关注的焦点。,生物技术是一把双刃剑，对人类有利也有弊 益处：改造农作物，使其产生对病虫害的抵抗力； 利用生物技术生产农药 利用生物技术改造家畜和家禽 利用生物技术使其内源性生长激素增加 利用生物技术检测食品的安全性 对人类不利：如果对生物技术不加以管理，就会对人类产生灾难性的后果，这些后果有短期的，也有长期的 生物技术对人类的潜在危害在其发展的初期就被科学家们认识到了，在发展现代生物技术食品的同时，相应的管理和安全性
2、评价也在世界各国展开,二、生物技术食品安全性评价的基本内容,生物技术食品的安全性是现代生物技术食品发展过程中首先面临的问题之一 利用基因工程技术生产的食品，作为一种新型的食品种类 安全性问题一直是科学界、政府、消费者关注的热点。,1、生物技术食品安全性评价问题的由来,1953年Watson和Crick 遗传物质DNA双螺旋结构 20世纪60年代末斯坦福大学教授Berg DNA与猴病毒SV40的DNA连接重组DNA 1973年的Gordon会议 1975年Asilomar会议专门针对专基因生物的安全进行了讨论 美国国立卫生院依据专家会议的讨论结果制定了美国的生物技术管理条例,20世纪80年代后期
3、，第一例基因重组生物技术食品牛乳凝乳酶商品化生产 1993年OECD出版了由现代生物技术生产的食品的安全性评价概念与原则 1994年世界卫生组织在召开了名为“实质等同性在评估由现代生物技术培育的植物食品或者食品成分的安全性方面的应用”讨论会 1996年OECD又出版了一部关于食品安全性评估的专题讨论论文,1996年世界卫生组织和联合国粮农组织 于在罗马共同召开了名为“生物技术和食品安 全”的研讨会。 1996和2000年的FAO/WHO专家咨询会议 以及2000年和2001年在日本召开的世界食品法典委员会（CAC）转基因食品政府特别会议对 “实质等同原则”给予肯定。,2、转基因食品安全性评价的
4、目的与原则,安全性评价的目的 提供科学决策的依据 保障人类健康和环境安全 回答公众疑问 促进国际贸易，维护国家权益 促进生物技术的可持续发展 安全性评价的原则 遗传工程体特性分析 实质等同性原则,安全性评价的原则,（1）遗传工程体特性分析 供体 来源、分类、学名，与其他物种的关系；作为食品食用的历史，有无有毒史、过敏性、传染性、抗营养因子、生理活性物质，该供体的关键营养成分等 被修饰基因及插入的外源DNA 介导物的名称、来源、特性和安全性。基因构成与外源DNA的描述，包括来源、结构、功能、用途、转移方法、助催化剂的活性等 受体 与供体相比的表型特性和稳定性，外源基因的拷贝量，引入基因移动的可能
5、性，引入基因的功能与特性。,（2）实质等同性 将转基因植物、动物、微生物产生的食品分为三类 转基因食品与现有的传统食品具有实质等同性 除某些特定的差异外，与传统食品具有实质等同性 与传统食品没有实质等同性,什么叫实质等同性,实质性等同性原则 当某个有转基因技术生产的新食品的各项主要特征（分子学特征、遗传形状、主要营养成分等）与现有食品大体相同，则认为该新食品的安全性也与现有食品大体等同,实质等同性的主要内容,（1）生物学特性的比较 对植物来说包括形态、生长、产量、抗病性及其他有关的农艺性状 对微生物来说包括分类学特性（如培养方法、生物型、生理特性等）、定殖潜力或侵染性、寄主范围、有无质粒、抗生
6、素抗性、毒性等 动物方面是形态、生长生理特性、繁殖、健康特性及产量等,（2）营养成分比较 包括主要营养因子、抗营养因子、毒素、过敏原等。主要营养因子包括脂肪、蛋白质、碳水化合物、矿物质、维生素等； 抗营养因子主要指一些能影响人对食品中营养物质的吸收和对食物消化的物质，如豆科作物中的一些蛋白酶抑制剂、脂肪氧化酶以及植酸等。 毒素指一些对人有毒害作用的物质，在植物中有马铃薯的茄碱、番茄中的番茄碱等。过敏原指能造成某些人群食用后产生过敏反应的一类物质，如巴西坚果中的2S清蛋白,在进行评价是应根据下列情况分别对待 与现有食品及食品成分具有完全实质等同性 与现有食品及成分具有实质等同性，但存在某些差异
7、与现有食品无实质等同性,转基因食品安全性评价原则实质等同性原则,将转基因食品分成三类： 比较结果 评价内容 1. 实质性等同 不必做评价，新食品是安全的 2. 除引入的新性状外， 仅评价转基因产物及其 具有实质性等同 催化产生的其它物质 3.不具实质等同性 全面分析新食品的营养性和安全性 鉴于此，对转基因食品安全性应采取个案分析的方法，而不能一概而论。,3、转基因食品安全性评价的几个主要问题,过敏原 毒性物质 抗生素抗性标记基因,食物过敏是人类食物使用史上一个由来已久的卫生问题 食物过敏常发生在某些特殊人群，全球有近2成年人和4 6 的儿童有食物过敏史 食物过敏是指在食品中含有某些能引起人产生
8、不适反应的抗原分子，这些抗原分子主要是一些蛋白质，这些蛋白质具有对T-细胞和B-细胞的识别区，可以诱导人免疫系统产生免疫球蛋白E抗体（IgE).,转基因食品安全性的确定按以下步骤进行 第一步，是作目标蛋白的免疫反应分析 如果基因来自一种常见过敏原种血清,14种血清的分析 如果基因来自一种不常见的过敏原种血清, 5种血清 第二步，如果转基因食品中含常见的过敏原基因，体外免疫试验分析为阴性或结果模棱两可，则转基因食品必须作进一步的皮肤穿刺试验，皮肤阳性即足以证明转基因食品的提取物能促发皮肤嗜碱白细胞释放组胺。 第三步，也就是最后对过敏病人作双盲、以安慰剂做对照的食物实验,以确定转基因食品的安全性,
9、基因来源（过敏性）,固相免疫分析常见过敏原和不常 见过敏原（8类，106种食品）,是,序列相似性1,否,阳性,消化/加工稳定性,皮肤传次试验,DBPCFC (IRB),标签 表明来源,市场,请示监控机构,阴性 3,阴 性4,阳 性,阳 性,阳性,阳性,阴性,阴性 2,阳性,注:1与所有已知的过敏原比较氨基酸序列相似性,分析所有基因产物对消化的稳定性 2固相免疫分析取决于能用多少血清.理想的血清是14种.如果少于5种,分析结果为阴性,则进行消化/加工稳定性测试,结果为阳性时应请示相应的监控机构 3如果结果模棱两可或怀疑为阴性,则进入皮试 4根据固相免疫分析和皮试结果,如果没有证据证明有过敏性,则
10、进行食品的DBPCFC试验. DBPCFC表示双盲,以安慰剂作对照的食物试验,为保证没有过敏性,DBPCFC实验必须经IRB批准,来源于生物技术食品潜在过敏原 的评价程序 FAO/WHO2001,外源基因是否来源于已知过敏原生物,比较氨基酸序列同源性,比较氨基酸序列同源性,特异性血清 筛选实验,定向血清 筛选实验,可能是 过敏源,胃蛋白酶笑话实验 和 动物模型实验,+/+ 高 可能的过敏源,+/- -/- 低 非过敏源,是,否,是,是,否,是,否,否,否,毒性物质 是指那些有动物、植物和微生物产生的对其他中生 物有毒的化学物质 从化学的角度看 毒性物质包括了几乎所有类型的化合物 从毒理学方面看
11、 毒性物质可以对各种器官和生物靶位产发生化学和物理化学的直接作用，因而引起机体损伤、功能障碍以及致畸、致癌、甚至造成死亡等各种不良胜利效应,抗生素抗性标记基因 抗生素抗性基因所编码的酶在消化时对人体产生的直接效应 抗生素抗性基因水平转入肠道上皮细胞肠道微生物的潜在可能性 抗生素抗性基因水平转入环境微生物的潜在可能性 未预料的基因多效性,三、食品安全的生物技术检测方法,现代分子检测技术 （1）免疫学检测技术 （2）核酸检测技术 （3） 转基因食品的检测技术 （4）生物芯片与生物传感器的检测技术,1、免疫学检测技术,免疫学基础知识 抗原和抗体（免疫球蛋白）之间的结合特异性是免疫学检测技术的基础 在
12、检测中，抗原应该是要检测的对象，而抗体是抗原刺激产生的具有对抗原特异结合能力的免疫球蛋白 从目前的现代分子检测技术而言，免疫学检测方法是最特异、做灵敏、用途最广泛的技术之一,免疫检测技术的主要方法 （1）凝集反应 指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可以通过肉眼或显微镜观察的现象,（2）沉淀反应 当抗原为可溶性分子时，在与抗体结合后就形成沉淀。其包括： a 絮状沉淀反应 b 环状沉淀反应 c 双向扩散 d 单项免疫扩散 e 微量免疫电泳 f 对流免疫电泳 g 火箭电泳,双向扩散,单向扩散,（3）酶联免疫吸附测定法(ELISA) 是 酶免疫技术的一种。其优点如下: a 专一性强 b 灵敏度高 c
13、样品易于保存 d 结果易于观察 e 可以定量测定 f 仪器和试剂简单，操作比较简单，操作人员不需采取安全防护措施。,ELISA的几种主要方法,用间接ELSIA法检测特异性抗体 直接ELISA检测方法 双抗夹心ELISA检测方法测定抗原 双抗夹心ELISA检测方法测定特异性抗体 竞争ELISA法测定抗原 酶的交联技术,辣根过氧化物酶 二氨基联苯胺 深褐色 沉淀 5-氨基水杨酸 棕 色 449 邻苯二胺 橘红色 492、460 邻连甲苯胺 蓝 色 425 4-硝基酚磷酸 黄 色 400 碱性磷酸酶 萘酚-As-Mx磷酸盐 红 色 500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖 黄 色 405、42
14、0,表8-1 免疫酶技术常用的酶-底物系统,酶 底物 显色反应 测定波长(nm）,（4）单克隆抗体 单克隆抗体是指在一株B淋巴细胞中的每一个细胞只能产生一种它所专有的、针对一种它能识别的抗原决定簇的抗体，从这样的一株B细胞系产生的抗体即为单克隆抗体。,操作步骤 1、抗原制备 2、免疫动物 3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备 4、细胞融合 5、杂交瘤细胞的选择培养 6、杂交瘤细胞的筛选 7、杂交瘤细胞的克隆化 8、单克隆抗体的检定 9、分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立 10、单克隆抗体的大量制备,单克隆抗体制备示意图,2、核酸分子检测技术,聚合酶链式反应（PCR) Southern杂交 Northern杂交 连接链式反应（LCR) PCR-ELISA检测,PCR反应原理,PCR反应原理,没有产物 反应不平衡 检查反应各组分浓度 反应循环条件 检查反应循环条件 多加或漏加某种成分 用同样模板和试剂重复反应 模板浓度太低 增加模板的浓度 引物浓度或顺序不优化 优化引物的浓度或重新设计引物 模板质量太差 使用可以扩增小片段的引物 （降解、污染、含抑制因子） 尝试加入DMSO和去污剂增加 反应效率 控制Mg浓度1.55.0mmol 选择合适的DNA提取方法重新 提取高质量的DNA模板 将常用模板贮存在4冰箱 Tap酶量不够或活力低 用阳性对照和引物扩增
