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1、山东大学齐鲁医院 高海青 中国 昆明,天然药物葡萄子原花青素 与糖尿病血管病变,主要内容,概述 葡萄子原花青素抗内皮细胞糖基化损伤 葡萄子原花青素抗糖尿病靶器官损害 基于蛋白质组学技术探讨其作用靶点 葡萄子原花青素应用前景,糖尿病流行病学,2030年,Reference: Wild S, Roglic G, Green A, Sicree R, King H. Global prevalence of diabetes. Diabetes Care. 2004; 27(5): 1047-1053.,糖尿病血管病变,微血管病变,肾病 （蛋白尿）,视网膜病（失明）,大血管病变,缺血性心脏病（心肌梗
2、死）,脑动脉硬化 （中风）,末梢血管病变(足坏疽),神经病变（手脚麻木）,研究背景,糖尿病血管病变发病机制： 多元醇途径 己糖胺途径 蛋白激酶C途径 糖基化终末产物形成途径 Brown Lee教授研究表明四条病理性通路的共同机制为线粒体电子传递链上过氧化物的过度产生 因此，有效阻断氧化应激、抑制AGEs的形成及交联、阻 断AGEs与受体的作用将是防止糖尿病慢性血管并发症的重要 途径，而对此开发有效药物也是当前医药界的研究热点,研究背景,糖尿病血管病变发病机制,己糖胺途径,多元醇途径,蛋白激酶C途径,糖基化终末产 物形成途径,Brownlee M. Nature, 2001, 414(6865)
3、:813-820.,Brownlee M. Nature, 2001, 414(6865):813-820.,Brownlee M. Nature, 2001, 414(6865):813-820.,线粒体电子传递链上过氧化物的过度产生,研究背景,葡萄子原花青素（GSPE）是从葡萄子中提取的一种多酚类化合物 具有强大的抗氧化和抗非酶糖基化作用 一种天然植物成分，资源丰富 制备简单，价格低廉 无明显的毒性反应,研究背景,体外实验： 葡萄子原花青素抑制内皮细胞糖基化损伤的作用机制 体内实验（一）： 葡萄子原花青素对糖尿病大鼠主动脉、心脏、肾脏、海马、视网膜组织的保护作用 体内实验（二）： 基于蛋白
4、质组学技术探讨葡萄子原花青素保护糖尿病靶器官的作用靶点,研究背景,GSPE抑制AGE-BSA诱导的内皮细胞ROS产生（LSCM）,注：组17分别代表组对照组、BSA组、GSPE组、AGE-BSA诱导组、5 g/ml GSPE治疗组、15 g/ml GSPE治疗组、25 g/ml GSPE治疗组；与对照组相比，p0.01；与AGE-BSA诱导组相比，p0.05，p0.01,葡萄子原花青素内皮细胞,Gao Hai-qing et al. J Cardiovasc Pharmacol. 2006;48:47-53.,GSPE选择性抑制AGE-BSA诱导的内皮细胞黏附分子表达,葡萄子原花青素内皮细胞,
5、Gao Hai-qing et al. J Cardiovasc Pharmacol. 2006;48:47-53; Gao Hai-qing et al. J Cardiovasc Pharmacol. 2007;49:293-8.,GSPE抑制AGE-BSA诱导的内皮细胞RAGE mRNA表达,注：组17分别代表组对照组、BSA组、GSPE组、AGE-BSA诱导组、5 g/ml GSPE治疗组、15 g/ml GSPE治疗组、25 g/ml GSPE治疗组；与对照组相比，p0.01；与AGE-BSA诱导组相比，p0.01,葡萄子原花青素内皮细胞,Gao Hai-qing et al. J
6、Cardiovasc Pharmacol 2007;50:434-440.,糖尿病模型的建立,葡萄子原花青素分组,PWV（cm/s）=d/t,葡萄子原花青素PWV测定,肾脏,主动脉,葡萄子原花青素标本取材,心肌,标本取材,海马,坐骨神经,葡萄子原花青素标本取材,视网膜,主动脉形态学观察,弹性模量（EM）和壁应力（WS）分别用Moens-Korteweg公式和Lame公式计算： EM=(PWV2Di)/h；WS= (CAMBPDi)/2h， 为血液密度（1.05 g/ml）,GSPE对主动脉组织形态学的影响,注：C1组：正常对照组；C2组：GSPE正常治疗组，每日予GSPE 250mg/kg灌胃
7、；DM1组：糖尿病未治疗组；DM2组：糖尿病GSPE治疗组，每日予GSPE 250mg/kg灌胃,葡萄子原花青素糖尿病大鼠,Gao Hai-qing et al. Biosci Biotechnol Biochem. 2009;73(6):1348-54.,GSPE对糖尿病大鼠壁厚度/内径、PWV、WS和EM的影响,注：C1组：正常对照组；C2组：GSPE正常治疗组，每日予GSPE 250mg/kg灌胃；DM1组：糖尿病未治疗组；DM2组：糖尿病GSPE治疗组，每日予GSPE 250mg/kg灌胃,葡萄子原花青素糖尿病大鼠,Gao Hai-qing et al. Biosci Biotechn
8、ol Biochem. 2009;73(6):1348-54.,GSPE对心肌组织形态学的影响,注：C1组：正常对照组；C2组：GSPE正常治疗组，每日予GSPE 250mg/kg灌胃；DM1组：糖尿病未治疗组；DM2组：糖尿病GSPE治疗组，每日予GSPE 250mg/kg灌胃,葡萄子原花青素糖尿病大鼠,Gao Hai-qing et al. J Cardiovasc Pharmacol. 2007;50:503-9.,GSPE对肾脏组织形态学和RAGE表达的影响,注：C1组：正常对照组；C2组：GSPE正常治疗组，每日予GSPE 250mg/kg灌胃；DM1组：糖尿病未治疗组；DM2组：糖
9、尿病GSPE治疗组，每日予GSPE 250mg/kg灌胃,葡萄子原花青素糖尿病大鼠,Gao Hai-qing et al. J Nephrol. 2008;21(5):722-33； Gao Hai-qing et al. Nephron Exp Nephrol. 2009;111(2):e31-41.,GSPE对视网膜组织形态学的影响,注：C1组：正常对照组；C2组：GSPE正常治疗组，每日予GSPE 250mg/kg灌胃；DM1组：糖尿病未治疗组；DM2组：糖尿病GSPE治疗组，每日予GSPE 250mg/kg灌胃,葡萄子原花青素糖尿病大鼠,Gao Hai-qing et al. Chin
10、 Med J (Engl). 2008;121(24):2544-52.,GSPE对海马组织形态学和RAGE表达的影响,注：C1组：正常对照组；C2组：GSPE正常治疗组，每日予GSPE 250mg/kg灌胃；DM1组：糖尿病未治疗组；DM2组：糖尿病GSPE治疗组，每日予GSPE 250mg/kg灌胃,葡萄子原花青素糖尿病大鼠,Gao Hai-qing et al. Exp Clin Endocrinol Diab. 2008;116(4):215-24； Gao Hai-qing et al. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 2009;55(3):223-30.
11、,GSPE对坐骨神经组织形态学的影响,注：C1组：正常对照组；C2组：GSPE正常治疗组，每日予GSPE 250mg/kg灌胃；DM1组：糖尿病未治疗组；DM2组：糖尿病GSPE治疗组，每日予GSPE 250mg/kg灌胃,葡萄子原花青素糖尿病大鼠,Gao Hai-qing et al. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 2008;54(4):321-8.,GSPE对糖尿病大鼠主动脉、心肌、肾脏、视网膜、海马等组织具有保护作用； 保护机制：AGEs-RAGE 核转入因子kappa B (NF- B) 该信号通路在糖尿病慢性血管并发症中具有重要作用 目前，仅初步明确了G
12、SPE对糖尿病靶器官的保护机制，但其作用靶点尚未阐明，因此，我们应用蛋白质组学技术深入探讨了GSPE对糖尿病主动脉、肾脏、视网膜组织作用靶点,结论,蛋白质组学流程图,2-D difference gel electrophoresis (2-D DIGE) Workflow,研究方法DIGE流程图,葡萄子原花青素DIGE图谱,大鼠主动脉、肾脏、视网膜组织样品 2-D DIGE图谱(13cm, pH 310, NL),主动脉,肾脏,视网膜,Line images and 3D images of some spots,葡萄子原花青素折线图和3D图,LTQ-ESI-MS/MS:MS spectra
13、 and MS/MS spectra,葡萄子原花青素质谱图,差异表达蛋白,葡萄子原花青素差异表达蛋白,Gao Hai-qing et al. J Cell Biochem. 2008;104(2):668-79; Gao Hai-qing et al. Int J Mol Med. 2010;25(2):237-48; Gao Hai-qing et al. Chin Med J (Engl). 2008;121(24):2544-52.,主动脉差异蛋白定位分析,葡萄子原花青素定位分析,主动脉差异蛋白功能分析,葡萄子原花青素功能分析,结论,获得了稳定可靠的大鼠肾脏、主动脉、视网膜组织（正常对照
14、组、糖尿病未治疗组和糖尿病GSPE治疗组）的2-D DIGE图谱，并得到各组的差异表达蛋白 这些差异蛋白主要与信号转导、细胞增殖、凋亡、糖、脂、氨基酸代谢有关 糖尿病大鼠经GSPE上调或下调的蛋白，揭示了GSPE保护糖尿病靶器官的候选作用靶点,结论,糖尿病大鼠经GSPE治疗后回调的差异蛋白的功能主要涉及到氧化应激、细胞增殖与凋亡、炎症反应和细胞代谢等病理生理过程 GSPE通过多种作用途径参与了蛋白表达的调控，这些新发现的药效相关蛋白，既可以为认识疾病发病机理提供线索，也可以作为疾病诊断的分子标记，还可以为临床上糖尿病患者并发症的治疗寻求和设计更为有效的药物提供候选靶点，并为天然药物和中药靶点的筛选提供新的研究途径,葡萄子原花青素应用前景,国际葡萄子原花青素是一种很有开发价值的天然植物药，它经历了40多年的研究开发，风靡欧洲、日本和美国等地 国内我国也在大力开发利用葡萄子原花青素；为此，科学家建议,把一向遭废弃的葡萄子利用起来,通过加工,用于生产保健品和药品,造福于人类,谢谢！,
